腎移植術后血和尿中BKV、JCV的檢測及意義

尚麗紅,游瑞君,武小桐,王振興,張文艷

(山西省第二人民醫院腎移植中心，山西 太原030012)

多瘤病毒屬于乳多空病毒屬，其中BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)可以使人類致病。在腎移植病人，免疫功能低下[1-3]，多瘤病毒的潛伏感染率較高。約有10%~60%的腎移植患者可再次激活多瘤病毒，但不影響腎功能；1%~10%的腎移植患者可發生多瘤病毒相關性腎病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[4]。

BKV是導致PVAN的主要原因[5]，與JCV具有75%的序列同源性[6]。據報道[6]，大約3%的JCV感染患者可導致PVAN的發生；但如果JCV與BKV同時發生感染的患者，PVAN發生的機率將上升到15%[7]。目前，尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當地調整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復制，但又增加引發排斥反應的風險。因此，建立快速、有效的檢測方法，對PVAN的早期預測和診斷對腎移植患者預后有著重要的臨床意義。

目前，常用的檢測方法[8,9]有：(1)尿液誘耳細胞(decoy細胞)細胞學檢測；(2)尿液、血液中PCR檢測DNA；(3)免疫組化檢查。近年來，人們推崇無創性檢測方法，即采用PCR檢測體液病毒DNA作為篩選。利用PCR方法檢測這兩種病毒具有更高的靈敏度和特異性，對監測腎移植術后患者多瘤病毒的感染、及早發現和治療都具有指導作用。

因此，本文利用熒光定量PCR(探針法)方法，檢測腎移植術后患者體內的BKV和JCV含量，為患者的臨床診斷和治療方案提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 分別收集山西省第二人民醫院腎移植中心2013年6月至2014年5月期間腎移植術后患者尿液標本153例、血液標本155例，其中男性92例，女性61例。所有患者自愿接受BKV、JCV病毒的檢測。

1.2 實驗標本和試劑 在患者行腎移植術后，收集尿液和血液。具體收集方法如下：(1)血漿樣本采集：用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3～5ml，注入含有EDTA的無菌收集管，立即輕輕顛倒混勻，室溫放置不超過4h，待樣本自行析出血漿或直接室溫1600rpm離心5min分離出血漿，轉移到1.5ml滅菌離心管中備用。(2)尿液樣本采集：留取中段晨尿10～20ml(不超過容器體積的2/3)密封送檢。(3)樣本保存：樣本應盡快檢測，4℃保存不超過24h，-20℃條件下可以保存數月，-70℃條件下可以長期保存，但不可反復凍融。BK/JC病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自于北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板提取 (1)血漿或血清①在1.5ml離心管中加入100μl待測樣本，然后加入50μl濃縮液，振蕩15s混勻；②將上述離心管放入臺式離心機，13000r/min離心10min后取出；③小心吸出150μl上清液(盡量吸干上清液，但不要觸及沉淀)并棄去，保留沉淀；④向離心管中分別加入25μl裂解液，然后用吸頭對準沉淀所在位置，將其挑離管底，并吹洗5次(關鍵步驟)；⑤振蕩15s將沉淀充分打散；⑥100℃條件下溫育10min；⑦13000r/min離心10min后將上清液轉移至新的離心管，該上清液即純化的DNA溶液。(2)尿液將尿液送檢管振蕩15s，徹底混勻(關鍵步驟)；取其中 1ml至 1.5ml離心管中，13000r/min離心10min后棄去上清；加入50μl裂解液，然后用吸頭對準沉淀所在位置，將其挑離管底，并吹洗5次(關鍵步驟)；之后參照上述血漿或血清樣本操作5～7步驟。

1.3.2 定量PCR檢測腎移植患者術后BKV和JCV感染 (1)試劑配制：確定反應數N，N=待檢樣本數(n)+定量標準品(4)+陰性質控品(1)+1。計算加到反應混合物中的各個試劑的量，分別添加BKVPCR反 應 液 8.5μl×N、BKV 酶 混 合 物 0.5μl×N、BKV PCR 增強劑 10μl×N、BKV 內標模板 1μl×N。 取無菌離心管配制反應體系，試劑全部加入后振蕩15秒，2000r/min離心15s。然后將上述混合液 20μl/管分裝至PCR反應管中。(2)PCR反應：分別取BKV/JCV陰性質控品、已處理樣本和BKV定量標準品I～IV 5μl加入 PCR 反應管中，蓋緊管蓋，2000r/min離心15s將管壁上的液體全部甩至管底，如有氣泡輕彈管壁將氣泡彈出，再次離心去除氣泡，然后立即進行PCR擴增反應。具體設置程序見表1。

表1 PCR反應條件和程序

1.3.3 PCR數據分析 擴增PCR產物進行凝膠電泳檢測目的片段，并分析熒光擴增檢測結果。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 尿液和血液中BKV-DNA和JCV-DNA PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測，結果見圖1。

A BKV-DNA PCR擴增產物

圖1 尿液和血液中BKV、JCV的PCR擴增產物

2.2 尿液、血液中BKV-DNA和JCV-DNA定量檢測結果 BKV和JCV定量PCR檢測，用4個體外純化質粒作為定量標準品，進行PCR擴增并繪制標準曲線，且標準曲線的相關系數|R|(|r|)均大于0.99。腎移植術后患者BKV和JCV檢測的最低檢測限為 2×103copies/ml， 線性檢測范圍為 5×103～5×108copies/ml。

BKV-DNA在尿中的檢出率為33.3%(51/153)，載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間， 血液中檢出率 為 34.8%(54/155)， 載 量 在 1.3×103~6.06×105copies/ml之間。JCV-DNA在尿中的檢出率為31.3%(47/150)，載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間，血液中檢出率為34.6%(54/156)，載量在1.3×103~6.06×105copies/ml之間。發生病毒尿癥的中位時間為6.1月，發生病毒血癥的中位時間為4.9月。定量PCR檢測的標準曲線和擴增曲線，見圖2。

圖2 尿液和血液中BKV-DNA、JCV-DNA的PCR擴增曲線

2.3 PCR方法的靈敏度和特異性 BKV尿液和血液樣本靈敏度分別為98.31%和99.22%，特異性分別為100%和99.79%；JCV尿液和血液樣本靈敏度分別為97.90%和98.60%，特異性均為100%。本檢測方法對BKV和JCV檢測具有較高的特異性和靈敏度。見表2。

表2 BK病毒和JC病毒檢測試劑的靈敏度和特異性

3 討論

多瘤病毒屬乳多空病毒屬，目前已發現的多瘤病毒成員有13個，其中BKV、JCV和SV40與人類有關。BKV可引起移植腎功能異常或喪失；JCV可引起進行性多灶白質腦病(PML)；SV40則為猿類動物病毒。

在腎移植患者，由多瘤病毒感染的臨床表現既可以是病毒尿癥，也可以是明顯的腎臟、泌尿系異常。如輸尿管狹窄、一過性移植腎功能異常、間質性腎炎、出血性膀胱炎等，統稱為多瘤病毒相關性腎病 (Polyomavirus-associatednephropathy,PVAN)。10%～60%的腎移植患者在接受抗排斥治療程中有BKV感染 ，多見于術后3個月內。國外資料顯示，腎移植術后44周可有約5%的病例發生PVAN。如無恰當的處理，高達45%的病例在組織學確診后平均6個月轉變為移植腎失功。PVAN的發生可能與免疫抑制維持治療 (FK506，MMF及雷帕霉素)、腎小管上皮細胞損傷及再生、抗排斥治療等多因素密切相關。

BK病毒(BKV)屬多瘤病毒家族成員，感染后多以潛伏狀態存在，當宿主免疫功能低下時可重新激活。BK病毒原發感染發生在兒童時期，一般存在于人體泌尿道及外周血白細胞中，約0.5%～20%感染者會出現BKV激活，導致病毒復制，一般不會引起腎功能損害。但在接受免疫抑制治療的人群中，特別是腎移植術后患者，BKV再激活率會明顯增高，并可能導致BKV相關性腎病(BKV associated nephropathy，BKVAN)。 腎臟是健康人 BKV潛伏感染的主要部位，腎移植術后患者可在尿液中檢測到BKV，其中多數患者表現為無癥狀病毒血癥或暫時的移植腎功能異常，偶可在切除的移植腎標本中發現病毒引起的組織損傷。

近年研究發現，初次感染BKV后，BKV常潛伏于腎小管上皮細胞及尿路移行上皮細胞內，當宿主免疫力下降時，BKV可再次激活并開始迅速大量復制。腎移植術后患者BKV再次激活的發生率為10%－68%，約1%－7%的腎移植患者會出現BKVAN，其中50%會導致移植腎失功。

BKV是導致PVAN的主要原因[5]，與JCV具有75%的序列同源性。JCV可引起進行性多灶白質腦病(PML)，還能在腎臟組織中復制，并通過尿液排出病毒。器官移植后，免疫抑制劑的使用是誘導多瘤病毒激活復制的重要原因，其中，40%以上的腎移植患者可檢測到JCV的復制。據報道[6]，大約3%的JCV感染患者可導致PVAN的發生；但如果JCV與BKV同時發生感染的患者，PVAN發生的機率將上升到15%[7]。目前，尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當地調整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復制，但又增加引發排斥反應的風險。因此，建立快速、有效的檢測方法，對PVAN的早期預測和診斷對腎移植患者預后有著重要的臨床意義。

近年來，相對于其他又創性的檢測，人們更推崇無創性檢測方法，如采用PCR檢測血中病毒DNA。 Toyoda[10]和 Leung[11]等研究證明，BKV 定量PCR測定對于檢測BKV感染的發病過程非常有效，并建議聯系臨床現象和活檢所見判斷結果。PCR法檢測多瘤病毒的敏感性為100%，特異性為88%~95%[12,13]，在組織學檢查的陰性而PCR陽性的病人最終約有半數以上病人發展為PVAN，在這期間具有數周到數月的窗口期[14]。尿PCR檢測的靈敏度和特異性更高，但由于誘耳細胞內病毒包涵體可以是BKV或JCV[15]，因此尿脫落細胞檢測不能作BKV或JCV的特異性分型。實時熒光定量PCR檢測方法被認為是一種檢測病毒載量敏感性較高的非侵入性檢查。在臨床上，對腎移植術后患者血液和尿液中多瘤病毒進行定性、定量實時監測，可作為腎移植術后BKV相關性腎病(BKVAN)和多瘤病毒相關性腎病(PVAN)的早期診斷和篩選的方法。

據報道，腎移植受者Decoy細胞陽性率為29.4%~40.0%，病毒尿癥發生率為13.0%~34.7%，病毒血癥為5.0%~21.0%。其中病毒尿癥的發生率與本文檢測結果基因一致，而病毒血癥的發生率略高。BKV病毒血癥出現的原因可能有以下幾種：(1)腎小管上皮細胞的BKV激活后通過小管周的毛細管進入血循環中；(2)血癥和尿癥是BKV在尿上皮細胞和外周單核細胞各自激活的結果，兩者相互伴隨發生；(3)BKV病毒尿癥至少在一定程度上是血癥的一個反映，血癥中的病毒經過腎代謝進入尿中BKVAN。血液中BKV的出現反映了BKVAN的發展過程。

目前，關于多瘤病毒的研究報道很多[16]，但對腎移植患者的BKV和JCV相關的PVAN、以及移植腎的免疫排斥之間相互作用的研究尚不清楚，相信在不久將來，這方面的研究會成為焦點，為臨床治療不斷提供新的理論依據。

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