單側迷走神經干刺激對心力衰竭犬心室肌自主神經分布和功能失衡的改善研究

阿不都熱合曼·米吉提 戴曉燕 阿地力江·托合提

·論 著·

單側迷走神經干刺激對心力衰竭犬心室肌自主神經分布和功能失衡的改善研究

阿不都熱合曼·米吉提 戴曉燕 阿地力江·托合提

目的 探討單側迷走神經干刺激增加迷走神經活性，對心力衰竭（心衰）犬自主神經分布和功能及心功能的影響。 方法 雜種犬18只，隨機分為假手術組、心衰組和迷走刺激組，每組6只。假手術組置入起搏器不行起搏，心衰組及迷走刺激組建立心衰模型，心衰組右心室置入起搏器行250次／min快速起搏37 d，迷走刺激組置入起搏器起搏30 d后給予右側迷走神經干20 Hz刺激7 d。行超聲心動圖檢查平均動脈壓（MAP）和左室射血分數（LVEF），并行電生理儀監測靜息心率（HR）變化。采用免疫組織化學法檢測酪氨酸羥化酶（TH）和乙酰膽堿轉移酶（ChAT）陽性纖維表達情況。

慢性心力衰竭；迷走神經干刺激；酪氨酸羥化酶；乙酰膽堿轉移酶

慢性心力衰竭（心衰）是各種器質性心臟病的主要并發癥，死亡率高，而室性心律失常致死占心衰總死亡數的40%～50%［1］。國內外大量研究顯示：自主神經功能失衡在心衰的發病中占有重要地位，與心衰時心律失常、心室重構及猝死密切相關［2］。已有大量基礎研究和臨床證據表明迷走神經活性與心衰的結局之間存在相關性，但利用其活性治療心衰的研究尚處于初始階段［3?5］。2個潛在的治療方向己經被發現：一是使用慢性電刺激迷走神經，另一個是使用苯并噻氮類藥物（鈣離子拮抗劑）。本研究在快速起搏犬右心室誘發心衰模型的基礎上，探討刺激單側迷走神經逆轉心衰犬心室肌自主神經重構的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 成年健康雜種犬18只，雌雄不限，體質量（18.00±2.66）kg，由新疆醫科大學動物中心提供，動物質量屬于一級標準。隨機分為假手術組：雌性2只，雄性4只，平均體質量（18.29±3.54）kg；心衰組：雌性3只，雄性3只，平均體質量（18.09±2.14）kg；心衰＋迷走神經刺激組（迷走刺激組）：雌性2只，雄性4只，平均體質量（17.85±2.86）kg。假手術組分離右側頸外靜脈和迷走神經干，置入起搏器不行起搏刺激；心衰組給予起搏器刺激30 d后，分離迷走神經干后繼續起搏7 d；迷走刺激組給予起搏器刺激30 d后，分離迷走神經干置入電極刺激神經同時繼續起搏7 d。實驗設計及實施均經武漢大學人民醫院動物倫理委員會審核批準。

1.2 雜種犬慢性心衰模型制作［6］3%戊巴比妥鈉按

30 mg／kg靜脈注射麻醉犬，術中4 mg／次靜脈注射維持。建立氣管插管。犬右側頸部去毛，常規消毒鋪巾，在右頸部做一5 cm切口，分離出右側頸外靜脈，仔細剝離靜脈鞘后結扎遠心端，用眼科剪剪開靜脈直徑的1／4～1／3，靜脈提鉤提起靜脈壁時將電極頭小心送入靜脈，將起搏電極沿靜脈系統送入右心室尖，LEAD2000心內電生理儀（錦江電子）顯示aVR導聯呈大R波。連接并開啟起搏器（250次／min），縫合皮膚，打開起搏器開關實行起搏心律。術中及術后3 d均給予160萬U青霉素2次／d肌肉注射，預防切口及囊袋感染。30 d后，犬出現不同程度的食欲下降、活動減少、呼吸加快等心衰癥狀，平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）＜60 mmHg，左室射血分數（LVEF）＜50%證實心衰模型建立成功。犬在起搏器關閉和麻醉狀態下，完成右側迷走神經刺激器安裝后更換起搏器，以190次／min起搏頻率維持心衰7 d。

1.3 迷走神經刺激方法 分離右側頸部迷走神經，植入迷走神經刺激電極，電極的另一側連接神經刺激器。刺激參數為：電壓4～8 V、脈寬1 ms、頻率20 Hz。刺激時心率降低＞30%為刺激有效，刺激效果不達標時調整刺激電壓、頻率和刺激部位。置入神經刺激儀調試后縫合切口，持續刺激7 d。

1.4 心臟超聲檢查 采用DESAOTE超聲儀和10 S探頭，頻率10 MHz，掃查深度5 cm，檢查前關閉起搏器。測量LVEF、MAP，并行電生理儀監測靜息心率（heart rate，HR）變化。

1.5 酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和乙酰膽堿轉移酶（cholineacetyl?transferase，ChAT）免疫組化檢測 各實驗組于在體實驗結束后取左心室前壁組織進行石蠟包埋，切片。采用SP免疫染色法染色。陰性對照以PBS代替一抗，應用計算機輔助圖像分析系統（motic images 3000）計算神經密度。TH和ChAT著色表現為胞漿染成棕黃色為陽性結果。依顯色程度分為：陰性無顯色，淺棕黃色為陽性，棕褐色為強陽性。神經密度以神經纖維面積與總檢測面積比值表示（μm2／mm2），切片全部面積被分割成連續的1024 μm2×768 mm2大小的獨立視野，所有視野神經密度的平均值為該切片平均神經密度，每個切片中選擇5個神經密度最大和5個神經密度最小的視野，神經密度均值之差為局部神經分布的不均一性。

1.6 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（ˉx±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 快速起搏心室誘發心衰模型完成情況 快速右心室起搏30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP＜60 mm?Hg，LVEF＜50%，結合犬呼吸加快，心率加速，食欲下降等癥狀，心衰模型建立成功。

2.2 3組MAP、LVEF和HR比較 基礎狀態各組MAP、LVEF和HR比較差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP和LVEF值比假手術組減小，HR比假手術組增快，差異有統計學意義（P＜0.05）。心衰組MAP、LVEF和HR與迷走刺激組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗37 d后，心衰組MAP和LVEF值比假手術組和迷走刺激組顯著減小，HR比假手術組和迷走刺激組顯著增快，差異有統計學意義（P＜0.05），迷走刺激組MAP、LVEF和HR與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組犬MAP、HR及LVEF比較（ˉx±s，n＝6）

2.3 實驗37 d各組犬心室肌神經分布不均一性比較

與假手術組比較，心衰組TH和ChAT陽性神經密度不均一明顯增加，差異有統計學意義（P均＜0.05），迷走刺激組TH和ChAT陽性神經密度不均一未見明顯改變，差異無統計學意義（P均＞0.05）。假手術組TH和ChAT神經纖維特染棕色條索狀陽性染色表達；心衰組TH棕色和ChAT淺棕色條索狀蛋白表達減少；迷走刺激組可見淺棕色條索狀TH表達和大量深棕色條索狀ChAT陽性染色表達。見表2和圖1，2。

表2 實驗37 d后各組犬心室自主神經分布不均一性（ˉx±s，μm2／mm2，n＝6）

3 討論

圖1 實驗37 d各組犬左心室前壁TH陽性神經纖維表達（×400）

圖2 實驗37 d各組犬左心室前壁ChAT陽性神經纖維表達（×400）

目前慢性心衰動物模型的制作方法較多，有壓力或者容量負荷誘導心衰模型、缺血性心肌病模型、心臟快速起搏心衰模型、藥物誘導的心肌病模型、心肌肥厚和心衰轉基因動物模型等［7］。心衰動物模型的建立對研究心衰的發病機制、病理生理及疾病預防和治療起重要作用。長期快速右心室起搏（＞200次／min）導致的心衰模型酷似擴張性心肌病，本研究此種模型的優點是制作模型的方法較簡單并且創傷小，起搏誘導的心衰血流動力學，神經內分泌水平與人的心衰相似，可以用來研究慢性心衰不同階段的病理生理和分子生物學特征。本實驗結果顯示，快速右心室起搏30 d后，心衰組和迷走刺激組犬MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰犬模型建立成功，并且心衰組30 d和37 d時MAP和LVEF值比假手術組持續減小，提示心衰的嚴重程度隨起搏時間延長呈逐步進展的趨勢。實驗37 d時，迷走刺激組MAP和LVEF值比心衰組增加，與假手術組比較，差異無統計學意義，提示迷走神經干刺激可以改善心衰心功能和血流動力學。

臨床上評價心衰患者迷走神經活性是很困難的，目前僅能通過觀察HR加快，心率變異性降低尤其是高頻成分降低，或者低頻高頻降低間接實現［8］。HR可以反映迷走神經功能，粗略評估自主神經平衡。大規模臨床實驗表明，靜息HR＞90次／min比HR＜60次／min人群的心血管死亡率高2倍［9］。本研究顯示，實驗30 d時心衰組HR比假手術組明顯增加。實驗結果提示，心衰后自主神經功能失衡，迷走神經功能下降，導致HR增加。

在收縮性心衰時，神經和體液系統均被激活，以維持心功能。已有較充分的證據顯示，心衰患者的迷走神經調控亦出現異常。目前，已有多種藥物對心衰患者交感神經的過度激活有抑制作用，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等。但迷走神經調節異常的改善尚無有效藥物，因此，本研究將研究方向轉向了迷走神經調節的器械治療。本研究結果顯示，心衰是與迷走神經活動減弱密切相關的。迷走神經刺激可能會成為另一種有效治療心衰的方法。有研究表示超過3月的迷走神經刺激可以顯著減少心室體積，增加心室射血分數［10］。有研究利用迷走神經刺激器，對32例心衰患者進行長期刺激后發現：大多數患者的NYHA心功能分級至少提高一個級別，HR明顯下降，且隨時間延長而易于維持，生活質量、6 min步行距離和心臟彩超指標明顯好轉［11］。本研究證實，心衰組犬出現自主神經分布的不均一性，心衰組TH和ChAT陽性神經密度不均一均明顯增加，TH纖維蛋白表達增加和ChAT纖維蛋白表達下降；經迷走神經干刺激后，心室肌自主神經分布的失衡改善，ChAT纖維蛋白表達增加，同時血流動力學指標，射血分數及HR均恢復。本研究結果提示，慢性迷走神經刺激可以作為臨床潛在的逆轉心室重構的治療方向，并為迷走神經刺激作為治療心衰的臨床前期基礎研究提供理論依據。

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Effects of unilateral vagus nerve stimulation on the improvement of ventricular autonomic nerve distribution and functional imbalance in canine with heart failure

Objective To investigate the effects of unilateral vagus nerve stimulation on vagal activity，autonomic nerve distri?bution and function and cardiac function in canine with heart failure. Methods Eighteen dogs were randomly divided into sham op?eration group，heart failure group and vagal stimulation group，with 6 dogs in each group.Sham operation group received pacemaker implantation but no pacing；Heart failure group were implanted pacemaker at right ventricular and received 250 times／min pacing for 37 d to establish CHF model；Vagal stimulation group were implanted pacemaker and received 250 times／min pacing for 30 d，then the right vagus nerve was stimulated for 7 d（frequency：20 Hz）.Left ventricular ejection fraction（LVEF）and mean arterial pressure（MAP）were examined with ultrasonic apparatus.Resting heart rate（HR）was recorded with electrocardiogram monitor.The expres?sion of tyrosine hydroxylase（TH）and cholineacetyl?transferase（ChAT）protein were detected by immuno?histochemistry. Results After 30 d of right ventricular rapid pacing，MAP＜60 mmHg，and LVEF＜50%were defined as successful heart failure model.After 30 d，compared to sham operation group，MAP and LVEF decreased and resting HR increased significantly in heart failure group and vagal stimulation group（P＜0.05）.After 37 d，compared with the sham operation group and vagal stimulation group，MAP and LVEF was significantly reduced and resting HR significantly increased（P＜0.05）.TH and ChAT positive nerve density heterogeneity statisti?cally increased in heart failure group（P＜0.05）.The muscle fibers with positive expression of TH were increased and the muscle fi?bers with positive expression of ChAT were decreased in heart failure group.While the mucle fibers with postive TH expression or ChA T expression were increased in vagal stimutation group. Conclusions The unilateral vagus nerve stimulation increases vagus nerve activity，slows HR，recovers autonomic nerve homogeneous and function imbalance，improves heart function in heart failure canines.

chronic heart failure；vagus nerve stimula?tion；tyrosine hydroxylase；acetylcholine transferase

R 541.6

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.04.006 Abudureheman·Mijiti．Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；DAI Xiao?yan，Adilijiang·Tuoheti．Department of Cardiology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830011，China

2014?05?05）

830054新疆維吾爾自治區烏魯木齊市，新疆醫科大學（阿不都熱合曼·米吉提），830011新疆維吾爾自治區烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區人民醫院（戴曉燕，阿地力江·托合提）

戴曉燕，Email：1961459521＠qq.com

結果 行犬右心室快速起搏30 d后，MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰模型成功建立。實驗30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP和LVEF值比假手術組減小，HR比假手術組增快，差異有統計學意義（P均＜0.05）。實驗37 d后，與假手術組和迷走刺激組比較，心衰組MAP和LVEF值顯著減小，HR顯著增快，TH和ChAT陽性神經密度不均一明顯增加，差異有統計學意義（P均＜0.05）。心衰組TH棕色條索狀陽性纖維表達增加，ChAT淺棕色條索狀陽性纖維表達減少；迷走刺激組可見淺棕色條索狀TH表達和大量深棕色條索狀ChAT陽性纖維表達。 結論 單側迷走神經干刺激能增加心衰犬迷走神經活性，減慢心率，恢復自主神經不均一性分布和功能失衡，改善心功能。