家族性低鉀型周期性麻痹家系的基因分析

元紅花，高 宇，金銀實，南光賢

（吉林大學中日聯誼醫院神經內二科，吉林長春130033）

家族性低鉀型周期性麻痹家系的基因分析

元紅花，高 宇，金銀實，南光賢＊

（吉林大學中日聯誼醫院神經內二科，吉林長春130033）

家族性低鉀型周期性麻痹（hypokalemic periodic paralysis，HPP）是常染色體顯性遺傳性肌肉病，是一種以發作性的遲緩性癱瘓伴血鉀水平降低為特征的骨骼肌離子通道?。?］。肌無力經常累及四肢，嚴重者可死于呼吸肌麻痹或血清鉀降低所致的心律失常［2－4］。涉及的基因有CACNA1S基因和SCN4A基因。有近90%的患者被發現在上述基因編碼骨骼肌離子通道電壓感受器S4片段的外顯子上存在導致精氨酸替換的點突變［5］。通常由精神緊張、寒冷、感染、輸入葡萄糖溶液、體溫下降、代謝性堿中毒、麻醉以及應用類固醇藥物等誘發，給予補鉀治療后癥狀可基本消失。家族性低鉀型周期性麻痹的發病機制尚不明確，目前認為由上述兩基因突變導致的精氨酸替換而產生的“門控漏電流”為致病的關鍵［6］。該電流的持續存在導致骨骼肌細胞膜靜息電位穩態改變，在導致血鉀降低的誘因的存在下，出現無力的發作。此外，該電流的長期作用使肌細胞內鈉離子持續超載，產生細胞毒性，即使在發作間期，患者細胞也可能存在水腫和變性［7，8］。本文對一家族性低鉀型周期性麻痹家系通過遺傳基因分析的方法，探討有無基因突變位點，以進一步明確病因并指導治療。

1 資料與方法

1.1 病例資料

目標家系同一代中的6名成員，Ⅰ代夫妻二人均正常，無低鉀型周期性麻痹病史。Ⅱ代中6人有3人患有低鉀型周期性麻痹，均為男性。其下一代未見有低鉀性周期性麻痹病例發生。該家族中患病者3人發病形式基本相同，發病年齡基本在20－40歲之間，均在勞累或體育鍛煉后發病，主要累及四肢肌肉，發病前后無肌肉疼痛，未發現明顯心電圖異常，補鉀后癥狀很快消失。

1.2 研究對象

同一代中的6名成員，其6人中3人患有低鉀型周期性麻痹，均為男性。

1.3 基因檢測

1.3.1 全血基因組提取 ①取200μl血液，加入900μl 1×STMT顛倒混勻，靜置5min，12 000rpm離心2min，小心去上清。重復一次。②加入450μl Lysis Buffer A，震蕩，使之分散開。③60℃水浴30 min，其間顛倒混勻數次。④加入400μl Lysis Buffer B，顛倒混勻數次。⑤離心5min，將上清轉入離心柱，靜置2min，離心1min，去廢液。⑥使用wash Buffer A洗滌一次，Wash Buffer B洗兩次，晾干乙醇。⑦加入100μl雙蒸水，靜置5min，12 000 rpm離心2min洗脫，管底即為基因組。

1.3.2 引物合成 根據CACNA1S外顯子11、30和SCN4A外顯子12序列的上下游內含子序列設計如下引物：

引物序列退火溫度長度FC11TGACGAAACCCTGTCTCTATTA 62 1 027bp RC11GAGAAACCCCGTGAGAATAAGG FC30TGTGCCCAAGGATGGTCCCGAACTA 62 744bp RC30CTGGCTGGCATCCAAGCATCTGACA FS12TTTGCCTCCATCACTCACTTAT 62 633bp RS12CTCCACTGCTGCTCAAGGTCAT

引物合成后，12，000g，1min離心，用滅菌雙蒸水溶解引物至終濃度10μM。

1.3.3 PCR擴增基因 反應體系：

組成體積／μL 2×Taq PCR mix 25μl F上游引物（10μM）1μl R下游引物（10μM）1μl基因組模板1μl H2O To 50μl

反應程序：

1.3.4 PCR產物純化 ①將剩余樣品點樣在回收膠中，從瓊脂糖凝膠中把目的條帶切下，加入到滅菌離心管中，進行稱重；②在膠塊中加入相當于3倍凝膠體積的溶膠液A，于50℃水浴中放置10min，在水浴期間不斷將離心管緩慢上下顛倒，一直到完全溶解；③將之前得到的溶液加入到一個吸附柱CA2，進行13 000rpm離心30s，丟棄廢液；④再向吸附柱中加入漂洗液PW700μl，再進行13 000rpm離心30s，丟棄廢液；⑤繼續加入漂洗液PW500μl，給予13 000rpm離心30s，丟棄廢液后，把吸附柱取出放至收集管中，進行13 000rpm離心2min。將吸附柱放置于室溫中數分鐘，直至徹底晾干；⑥最后把吸附柱放入到新的離心管中，懸空滴加經過70℃預熱的洗脫緩沖液TE50μl，在室溫中放置2min后，13 000rpm離心1min。將DNA溶液手機，直接送測序。

1.3.5 測序 純化的PCR產物單向測序，測序引物為PCR擴增正向引物F。

2 結果

2.1 全基因組的提取

使用Whole Blood Ge－nomic DNAMin－i prep Kit血液基因組提取試劑盒提取人血液全基因組。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，各取2μl電泳檢測，見圖1。

圖1 電泳檢測結果

2.2 PCR擴增

見圖2－4。

圖2 FC30－1 072 bp取5μl檢測結果

圖3 FC30－744 bp取5μl檢測結果

圖4 FS12－633 bp取5μl檢測

2.3 測序結果

見圖5、6。

圖5 測試結果中SCN4A外顯子12測序圖

圖6 測試結果中CACAN1S外顯子11測序圖

3 討論

近年來通過遺傳學、分子生物學和電生理學的聯合研究發現，低鉀型周期性麻痹是由離子通道基因突變所致的離子通道病，涉及的離子通道基因包括編碼骨骼肌電壓門控鈣通道α1亞單位基因（CACNA1S）和編碼骨骼肌電壓門控鈉通道α亞單位基因（SCN4A）。1994年，Ptácek等［9］和Jurkat－Rott等幾乎同時報道了本病是由于二氫吡啶受體敏感的鈣離子通道（L型鈣通道）α1亞基（CACNA1S）的DNA序列點突變所致。此后1999年，Bulman等在編碼電壓門控鈉離子通道α亞單位的SCN4A基因上發現存在點突變（Arg669→His）。到目前為止，國內外研究者們在CACNA1S和SCN4A中已發現了多個突變位點。

在國內，主要有CACNA1S的R528G、R1239H、H916Q以及SCN4A的R672H／C基因突變型，分別存在于CACNA1S基因外顯子11、外顯子30及SCN4A外顯子12上。本實驗主要針對上述三段序列進行序列分析。根據CACNA1S外顯子11、30和SCN4A外顯子12序列的上下游內含子序列設計引物，利用PCR技術，獲得目的片段并進行體外擴增，最后對所獲得產物進行測序。通過家族中患者基因序列與正常家族成員基因序列及正常人基因序列相比較，明確患者是否存在基因突變以及基因突變類型。本實驗最終結果為未在此家族中成員中發現有CACNA1S基因及SCN4A基因突變。分析可能的原因如下：①家族成員中患者均為散發病例；②在本實驗中，僅對CACNAS1基因的30號外顯子、11號外顯子及SCN4A基因的12號外顯子進行測序，該家族成員中患者可能存在其他基因型突變；③并不是所有的家族性患者都存在有基因突變，目前約有20%家族性低鉀型周期性麻痹患者未能檢測到突變基因。④也有文獻報道，中國人群中CACNA1S基因和SCN4A基因的突變陽性率遠低于西方白種人，提示HPP的突變基因存在種族差異；除了目前報道的突變基因外，中國人群還存在其他致病基因或導致血鉀降低的因素。雖然在西方白種人中，HPP的發生原因是CACNA1S和SCN4A基因突變，但中國人群的發病原因可能與西方人群并不完全一致。因此，在此后的研究中，我們考慮需要尋找與西方白種人不同的突變基因，不能只局限于CACNA1S基因和SCN4A基因；同時可通過建立已知常見突變位點的動物模型，對其進行病理生理研究，以促進基因突變的研究。

［1］劉海玲，童曉欣.低鉀型周期性麻痹的研究進展［J］.卒中與神經疾病，2010，17：306.

［2］Peng CY，Pu CQ.Clinical significance of increase of serum creatine phosphate kinase in patients with periodic paralysis［J］.Med J Chin PLA，1999，24（2）：65.

［3］Qi KL.Clinical analysis in periodic paralysis with 57cases［J］.Acta Acad Med CPAF，2011，20（8）：650.

［4］Xin SM，Zhang QF，Xin MY.Clinical analysis of hyperthyreosis Complicated hypokalemic periodic paralysis［J］.Chin J Pract Intern Med，2001，21（6）：353.

［5］Matthews E，Labrum R，Sweency MG，et al.Voltage Sensor charge loss accounts for most nases of hypalemic Periodic Paralysis［J］.Neurology，2009，72：1544.

［6］Cannon SC.Voltage－sensor mutations in channelopathies of skeletal muscle［J］.J Physiol，2010，5889（Pt 11）：1887.

［7］Jurkat－Rott K，Weber MA，Fauler M，et al.k＋－dependent paradoxical membrane depolarization and Na＋overload，major and reversible contributors to weakness by ion channelleaks［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：4036.

［8］Jurkat－Rott K，Groowe J，Lehmann－Horn F.Pathophysiological role of omege pore current in channelopathies［J］.Front pharmacol，2013，3：112.

［9］Ptácek LJ，Tawil R，Griggs RC，et al.Dihydropyridine receptor mutations cause hypokalemic periodic paralysis［J］.Cell，1994，77.

2013－12－08）

1007－4287（2015）02－0306－04

＊通訊作者