探討miRNA表達比在多發性骨髓瘤中的預測作用

劉 波，李世龍，尤建宇，陳文忠，于 濤

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

探討miRNA表達比在多發性骨髓瘤中的預測作用

劉 波，李世龍，尤建宇，陳文忠，于 濤＊

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

目的探討miRNA（微小RNA）表達比在多發性骨髓瘤患者血漿中的預測作用。方法收集24例MM患者及30例正常對照的血漿標本，運用高通量芯片的方法將差異表達的miRNA進行篩選；對分析結果進行qRT－PCR驗證；用ROC曲線分析了miRNA表達比，找出最具預測潛能的組合型標志物。結果與正常血漿標本相比，基因芯片檢測出178個差異表達的miRNA，選取其中4個miRNAs在24例MM血漿標本和30例正常血漿標本進行驗證。其中miR－21在多發性骨髓瘤中比在正常人中有明顯的高表達，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p在多發性骨髓瘤中則是低表達；miR－21／miR－199a－5p的表達比表現出很高的靈敏度和特異度，可以作為診斷多發性骨髓瘤的組合型生物標志物。結論miR－21／miR－199a－5p表達比或許可以成為預測多發性骨髓瘤的生物標志物。

微小RNA；多發性骨髓瘤；生物學標記

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0259）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為骨髓惡性漿細胞異常增生的血液系統惡性疾病，其發病率僅次于白血病，居血液系統惡性疾病的第二位。盡管治療策略已從化療、自體造血干細胞移植演變為靶向藥物治療，使得多發性骨髓瘤的預后得到了顯著的改善，但多發性骨髓瘤仍是不可治愈的腫瘤之一。諸多研究已經表明，miRNA廣泛參與腫瘤的發生、發展及預后［1］，很可能是一類潛在的癌基因［2，3］或抑癌基因［4］，亦可以作為診斷或預后的生物標志物［5，6］。本研究旨在檢測miRNA表達比在多發性骨髓瘤血漿中的預測作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

24例多發性骨髓瘤血漿標本來自吉林大學中日聯誼醫院血液內科，30例健康對照組血液標本來自吉大中日聯誼醫院門診非惡性血液病病人的血漿標本，空腹抽取靜脈血4ml，用含EDTA抗凝劑的采血管采集。所有患者均符合張之南等主編的《血液病診斷和療效標準》（1998年）中提出的MM診斷標準及療效標準，患者知情同意。

1.2 主要材料和試劑

RNA提取所需TRLzol reagent以及電泳所需瓊脂糖購自Invitrogen（美國）公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT－PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒均購自蘇州吉瑪公司。基因表達譜芯片及miRNA芯片為Illumina芯片（美國）。三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自天津化學試劑公司，DEPC處理水購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 RNA的提取及逆轉錄

將裂解血按照TRLzol reagent（Invitrogen）說明書進行RNA抽提，按照Takara逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，－20℃保存.

1.4 芯片制備

將制備好血漿cDNA與雜交試劑混合，加入GEX－HBY和RNA－FREE水進行雜交。樣本經過室溫孵育、洗滌、干燥后，進行掃描及分析。

1.5 分析方法

使用lllumina BeadChip Reader對芯片進行讀取并獲取圖像，用lllumina BeadStudio Application分析數據。以正常血漿組為對照組，多發性骨髓瘤血漿組為實驗組，實驗組相對于對照組的差異表達作為差異miRNA。

1.6 qRT－PCR驗證差異表達miRNA

用熒光定量PCR儀（Stratagene MX3000P日本）對差異表達miRNA進行驗證，U6作為內參。hsamiR－21引物序列：UAGCUUAUCAGACUGA UGUUGA。hsa－miR－199a－5p引物序列：CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。hsa－miR－16引物序列：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。hsa－miR－125a－5p引物序列：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA。擴增條件：95℃預變性30s，95℃變性20 s，60℃退火延伸30s，50個循環。

1.6 統計學分析

使用SPSS18.0統計軟件進行統計學處理。ROC曲線采用MedCalc軟件。芯片數據采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多發性骨髓瘤血漿標本中miRNA的差異表達

與正常血漿標本相比，在多發性骨髓瘤血漿標本中共有178個差異表達miRNA，其中上調的62個，下調的116個（P＜0.05），見表1。

表1 基因芯片中miRNA的差異表達

2.2 實時熒光定量PCR驗證4個差異表達的miRNA

實時熒光定量PCR驗證結果顯示miR－21表現出明顯的上調趨勢（P＜0.05），而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p則表現出顯著的下調趨勢（P＜0.05），本結果與芯片結果一致，見圖1。

2.3 miRNA表達比的篩選

為了確定miRNA表達比在多發性骨髓瘤中的預測價值，采用Gordon等［5］的方法，將唯一上調的miR－21和3個下調的miRNA做比值，用ROC（受試者工作特征曲線）來確定哪組表達比具有最大的預測潛力（圖2）。發現miR－21／miR－199a－5p具有96%的靈敏度和100%的特異度（P＜0.05），而miR－21／miR－16的靈敏度和特異度均較差，miR－21／miR－125a－5p的特異度較差（表2）。后兩者均不適合作為診斷多發性骨髓瘤的腫瘤標志物。

圖1 四個差異表達的miRNA

3 討論

多發性骨髓瘤是一種源發于免疫系統淋巴細胞的惡性腫瘤。目前多發性骨髓瘤發病機制不清，治療效果不理想。因此尋找預測多發性骨髓瘤發病風險的腫瘤標志物極具有臨床推廣價值。許多研究已經證實，miRNA與腫瘤進展密切相關并對疾病的預后有預測價值［7－9］。

表2 三種miRNA表達比的靈敏度和特異度

圖2 3種miRNA表達比的ROC曲線圖

本研究對收集的多發性骨髓瘤血漿標本進行miRNA芯片檢測，發現了共有178個差異表達的miRNA。miR－21表現出明顯的上調趨勢，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p則表現出顯著的下調趨勢。在24個多發性骨髓瘤血漿標本里進行實時熒光定量PCR驗證，結果顯示與芯片結果趨勢一致，從而進一步證實了miRNA做為多發性骨髓瘤診斷的生物標志物的可能性。Michele等［10］證實頭頸部腫瘤中的miR－221／miR－375表達比具有93%的特異度和92%的靈敏度，故可作為頭頸部腫瘤診斷的生物標志物。本實驗的創新點在于明確了多發性骨髓瘤患者的miRNA表達變化，將一個上調的miRNA和三個下調的miRNA做比值，用受試者工作特征曲線來確定哪些miRNA表達比能具有預測價值。本實驗研究結果表明miR－21／miR－199a－5p具有96%的靈敏度和100%的特異度。與單純的miRNA表達變化相比，miRNA表達比具有更強大的預測能力，更小的誤診率和漏診率。

［1］Garzon R，Calin GA，Croce CM.MicroRNAs in cancer［J］.AnnuRev Med，2009，60：167.

［2］He L，thomson JM，Hemann MT，et al.A microRNA polycistron as apotential human oncogene［J］.Nature，2005，435（7043）：828.

［3］Voorhoeve PM，le Sage C，Schrier M，et al.A genetic screen implicates miRNA－372and miRNA－373as oncogenes in testicular germ cell tumors［J］.Cell，2006，124（6）：1169.

［4］Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.Ras is regulated by the let－7microRNA family［J］.Cell，2005，120（5）：635.

［5］Kobayashi E，Hornicek FJ，Duan Z.MicroRNA Involvement in Osteosarcoma［J］.Sarcoma，2012，359.

［6］Sita－Lumsden A，Dart DA，Waxman J，et al.Circulating microRNAs as potential new biomarkers for prostate cancer［J］.Br J Cancer，2013，108（10）：1925.

［7］Nora Bandi，Erilt Vassella.MiR－15a／16are regulated in nonsmall cell lung cancer and control celll cycle progression in asynergistic and Rb dependent manner［J］.Mol Cancer，2011，10（1）：55.

［8］Selcuklu SD，Donoghue MT，Spillane C.miR－21as a key regulator of Oncogenic processes［J］.Biochem Soc Trans，2009，37（4）：918.

［9］Asaga S，Kuo C，Nguyen T，Terpenning M，Giuliano AE，Hoon DS.Direct serum assay for microRNA－21concentrations in early and advanced breast cancer［J］.Clin Chem 2011，57：84.

［10］Avissar M1，Christensen BC，Kelsey KT，et al.MicroRNA expression ratio is predictive of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（8）：2850.

Studies on the roles of miRNA expression forecast in multiple myeloma

LIU Bo，LI Shi－long，YOU Jian－yu et al.（De－

partment of Orthopedics，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveWe sought to identify microRNA altered in multiple myelomaand determine that microRNA ratio is an predictive tool for multiple myeloma.MethodsThe plasma of MM patients and 30normal controls were choosed and cofirmed，Respectively.The miRNA expression profiles were examined with Illumina Bead Chips.The results were verified by qRT－PCR.The miRNA expression ratio was analysed by ROC curve，aiming to find the most predictive potential of combination－type markers.Results178miRNAs were found to be significantly deregulated in the plasma of 24MM patients and 30normal controls plasma samples.miR－21were significantly higher than in normal plasma sample，while miR－199a－5p，miR－16and miR－125a－5p showed low expression；Furthermore，the ratio of miR－21／miR－199a－5p showed a high sensitivity and specificity for disease predicition.ConclusionThese results indicate that miR－21／miR－199a－5p ratio could be used as diagnostic biomarker in multiple myeloma.

MicroRNA；multiple myeloma.；Biological Marker

R733.3

A

2014－02－23）

1007－4287（2015）02－0259－03

＊通訊作者