系統性紅斑狼瘡患者外周血Th17與Treg細胞及相關細胞因子表達的研究

李 志，楊婷婷，李文哲，王 青，王 波，徐維家

（1.大連市中心醫院檢驗科，遼寧大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧大連116044）

系統性紅斑狼瘡患者外周血Th17與Treg細胞及相關細胞因子表達的研究

李 志1，楊婷婷1，李文哲2，王 青1，王 波1，徐維家1

（1.大連市中心醫院檢驗科，遼寧大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧大連116044）

目的檢測系統性紅斑狼瘡（SLE）患者輔助性T細胞17（Th17）和調節性T細胞（Treg）與其相關細胞因子在外周血中的表達。方法選擇38例SLE患者，根據病情嚴重程度SLEDAI評分進行分組；使用流式細胞儀檢測38例SLE患者和對照組Th17和Treg細胞的數量；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血漿中相關細胞因子的表達。結果SLE患者外周血中Th17細胞及其相關細胞因子IL－17、IL－23和IL－6顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），且疾病活動組的表達也顯著高于非活動組（P＜0.05）；此外與對照組相比，SLE非活動組Treg的表達降低（P＜0.05），并且疾病活動組的表達也低于非活動組（P＜0.05）；SLE活動組細胞因子TGF－β的表達高于非活動組和對照組（P＜0.05）。結論SLE患者外周血中Th17細胞及其相關細胞因子表達水平顯著升高，而Treg細胞的表達降低，兩者平衡被打破，提示Th17／Treg的失衡可能在SLE發病機制中發揮重要作用。

系統性紅斑狼瘡；輔助性T細胞17；調節性T細胞；白細胞介素17；白細胞介素23；白細胞介素6；生長轉化因子－β

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0253）

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，可累及多系統多器官。T淋巴細胞介導的自免反應在SLE病程過程中起了重要的作用。在不同的細胞環境中CD4＋T細胞可分化為不同的T淋巴細胞亞群，其中輔助性T細胞17（Th17）和調節性T細胞（Treg）在SLE發病過程中尤為重要［1］。本研究通過檢測SLE患者外周血Th17、Treg兩種T細胞亞群與其相關因子IL－17和TGF－β等的表達水平，探討Th17與Treg細胞平衡及其在SLE發病中的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取患者組為大連市中心醫院2011年5月至2012年5月的門診和住院SLE患者共38例，其中男5例，女33例，年齡22－56歲，平均（36.2± 12.51）歲；SLE的診斷符合美國風濕病學會1997年制定的SLE分類診斷標準［2］，平均病程（5.14± 4.56）。根據SLEDAI評分將患者分為活動組（≥10分）22例和非活動組（＜10分）16例。21名健康者作為對照組，平均年齡（40.35±10.21）歲。

1.2 主要試劑

CD3－FITC，CD4－PC5，CD4－FITC，CD25－PC5單抗、固定破膜劑IntraPrepTM購自美國Beckman公司；PE－IL－17，PE－Foxp3單抗及對照購自美國eBioscience公司；Foxp3Perm Buffer（10×）、Foxp3 Fix／Perm Buffer（4×）購自BioLegend公司；刺激劑PMA、離子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin購自美國Sigma公司；IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 標本采集和處理

受檢者清晨空腹靜脈采血兩份于肝素鈉抗凝管中：其中一份用于Treg細胞的檢測和密度梯度離心法Ficoll分離PBMCs后對Th17細胞的檢測；另一份離心保留血清用于ELISA試驗檢測細胞因子。

1.4 實驗方法

1.4.1 Th17細胞和Treg細胞的流式檢測

將分離出的外周血單核細胞及對照組加入CD3和CD4的酶標抗體進行表面標記，用于Th17細胞的標記；將標記后的PBMCs標本用RPMI－1640培養液洗滌，并加入到特殊培養液中（含新生牛血清、刺激劑等），放入37°溫箱孵育18－20h。培養后的細胞及對照組進行固定破膜之后加入酶標IL－17抗體和對照抗體，避光孵育30min后PBS洗滌。

取外周全血200μl及對照組加入CD4和CD25的單抗，用于Treg細胞的標記；將標記好的全血樣本用PBS洗滌后，進行固定破膜。最后加入酶標FoxP3抗體進行細胞內細胞因子的標記，對照管加入FoxP3對照抗體，孵育30min。最后，應用流式細胞儀測定標記細胞的熒光強度。

1.4.2 ELISA檢測血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的含量

對于IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的測定要嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 數據處理

用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以“均數±標準差（s）”表示，兩組間數據用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血中Th17、Treg細胞的表達

與對照組相比，SLE患者Th17細胞的比例顯著升高（P＜0.05），且疾病活動組Th17細胞的表達也高于非活動組（P＜0.05）；與對照組相比，SLE非活動組和活動組Treg的表達降低（P＜0.05），且活動組Treg的表達也明顯低于非活動組（P＜0.05），結果見表1。

表1 各組Th17及Treg細胞的表達

2.2 各組IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比較

SLE患者血清中IL－17、IL－23和IL－6的濃度較對照組顯著性升高（P＜0.05），且疾病活動組較非活動組也顯著升高（P＜0.05）；SLE活動組TGF－β的濃度高于非活動組和對照組（P＜0.05），而對照組與非活動組TGF－β的表達無顯著差異（P＞0.05），結果見表2。

表2 各組血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比較

3 討論

初始T淋巴細胞在不同的刺激條件下可分化為不同的T細胞亞群，各亞群發揮著各自的功能維持著免疫的平衡與穩定，既相互共生又相互抑制。系統性紅斑狼瘡患者自身免疫耐受被破壞，T細胞介導的自身免疫反應在SLE發病過程中發揮重要作用［3］。

初始T細胞在IL－6和TGF－β的共同作用下分化發育成Th17細胞［4］，研究發現Th17細胞與細胞因子IL－17、IL－6、IL－23等能夠參與自免疾病和炎癥反應。本研究顯示SLE患者Th17細胞高于健康對照組，且Th17的升高與疾病活動性相關，提示Th17與SLE的發生發展密切相關。IL－17通過誘導白介素－6，TNF－α等其他致炎因子的表達來介導炎癥細胞到局部的浸潤進而導致組織損傷。此外，白介素－17也參與了樹突狀細胞及中性粒細胞的成熟分化及趨化過程。除了IL－17外，Th17細胞還能分泌IL－17F，IL－21，IL－22等。此外，IL－23主要由活化的抗原遞呈細胞產生，不僅可以促進記憶性T細胞分泌IL－17，而且還能穩定擴增Th17細胞表型［1］，是IL－17直接有力的調節因子，在促進和維持Th17細胞分化方面發揮重要作用［5］。本實驗證實SLE患者IL－17、IL－23和IL－6的表達均顯著升高，推測Th17細胞相關細胞因子可能參與了SLE的發病過程。

但是如果僅存在生長轉化因子－β時，初始T細胞將不會分化為Th17而是向調節T細胞轉化并分泌TGF－β，并對免疫應答發揮負調控作用。已經證實SLE患者體內存在Treg細胞的缺陷，這一缺陷干擾了SLE患者免疫調節功能，喪失了對正常組織的免疫耐受，從而導致疾病的發生［6］，與本實驗結果相一致。TGF－β可抑制巨噬細胞和淋巴細胞等細胞的免疫功能，發揮免疫負調控作用，從而能夠維持免疫耐受的穩定狀態［7］。本實驗證實TGF－β在SLE患者體內表達減少，致使機體內的淋巴細胞的分化異常，產生多種自身抗體，可能是SLE發病的誘因之一。

健康的組織中Th17和Treg細胞并存、在分化過程中相互調節，在穩定狀態下，免疫系統未被激活，TGF－β促進Treg細胞的產生，Treg細胞以主動方式調控機體的免疫應答，使免疫系統既能清除異物抗原，又不會引起機體損傷而維持機體穩定。當機體受到病原體入侵時，內源性TGF－β與IL－6促進Th17的分化，而后隨著IL－6的水平降低，TGF－β又通過擴增維持調節T細胞的功能［1］。在許多的自身免疫疾病中，過度分化的致病T細胞和功能受損的調節T細胞打破了正常的免疫平衡狀態，使免疫系統向著促炎的狀態發展從而導致疾病的發生。紅斑狼瘡患者體內Th17細胞及IL－6和IL－17，IL－23等相關因子分泌明顯提高［8］，IL－17及B細胞激活因子共同作用促進B細胞產生致病的自身抗體。同時因為Treg細胞減少和Th17細胞的高表達而導致的Th17／Treg比例失調可作為SLE疾病的活動指數［9］。

可見Th17細胞和Treg細胞的分化發育相互制約，這依賴于各種致炎和抗炎因子的相互作用，二者平衡被打破時可導致SLE的發病。因此通過抑制致炎的Th17細胞的功能和分化并促進Treg細胞的數量及功能來調節兩者的比例使其達到平衡狀態對疾病的恢復可能是有益的，本實驗結果可能為SLE的發病機制研究及靶向治療提供依據。

［1］閆成蘭，張少然，陳俊偉.系統性紅斑狼瘡Th17／調節性T細胞平衡［J］.中國藥物與臨床，2012，12（3）：349.

［2］Hochberg MC.Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，1997，40（9）：1725.

［3］徐維家，李 志，楊婷婷，等.系統性紅斑狼瘡患者Th17和Th1細胞及其細胞因子水平的變化及臨床意義［J］.檢驗醫學，2013，28（5）：396.

［4］Kimura A，Naka T，Kishimoto T.IL－6－dependent and independent pathways in the development of interleukin 17－producing T helper cells［J］.PNAS，2007，104（29）：12099.

［5］Wilson NJ，Boniface K，Chan JR，et al.Development，cytokine profile and function of human interleukin－17－producing helper T cells［J］.Nat Immunol，2007，8（9）：950.

［6］尤海燕，陳軍浩，巢秀琴.系統性紅斑狼瘡患者外周血天然調節性T細胞檢測及臨床意義［J］.檢驗醫學，2008，23（1）：5.

［7］陳俊偉，張少然，閆成蘭，等.T輔助細胞亞型細胞相關因子在類風濕關節炎發病中的作用［J］.中國藥物與臨床，2012，12（4）：420.

［8］Doreau A，Belot A，Bastid J，et al.Interleukin 17acts in synergy with B cell－activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus［J］.Nat Immunol，2009，10（7）：778.

［9］Q.Xing，H.Su，J.Cui，et al.Elevated Th17cells are accompanied by FoxP3＋Treg cells decrease in patients with lupus nephritis［J］.Rheumatology International，2012，32（4）：949.

Studies on the population of Th17 and Treg cells and the expression of the correlated cytokines in SLE patients

LI Zhi1，

YANG Ting－ting1，LI Wen－zhe2，et al.（1.Department of Clinical Laboratory，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian 116033，China；2.School of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian Liaoning116044，China）

ObjectiveTo investigate the population of T helper 17cells and regulatory T cell in peripheral blood of system lupus erythematosus（SLE）patientsMethodsThirty－eigth patients with SLE were recruited，grouping according to SLE disease activity index score（SLEDAI）.The percentages of Th17and Treg cells were analysed by flow cytometric.Concentrations of Interleukin（IL）－17，IL－23，IL－6，transforming growth factor－βin plasma were used by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsThe percent of Th17and IL－17，IL－23and IL－6in SLE patients was significantly increased than that of normal controls（P＜0.05），and it was different between the high active and inactive group（P＜0.05）.The population of Treg cells in the patients group was significantly lower than normal controls（P＜0.05）；Concentrations of TGF－βin SLE active group were lower than inactive group and controls（P＜0.05）.ConclusionThe study suggests that Th17and Treg cells may play an important role in the pathogenesis of SLE.

System lupus erythematosus；T helper 17；Regulatory T cell；Interleukin（IL）－17；Interleukin（IL）－23；Interleukin（IL）－6；Transforming growth factor（TGF－β）

R593.24＋1

A

李志（1971－），男，碩士，主任技師，主要從事自身免疫及分子生物學研究。

2014－01－23）

1007－4287（2015）02－0253－03

大連市醫藥衛生科學研究項目