聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯／GDNF導管對大鼠脊髓損傷區(qū)GAP－43mRNA表達的影響

邵國喜，焦晶雪，劉欽毅，程兆華，李偉民

（吉林大學第二醫(yī)院骨科，吉林長春130041）

聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯／GDNF導管對大鼠脊髓損傷區(qū)GAP－43mRNA表達的影響

邵國喜，焦晶雪，劉欽毅＊，程兆華，李偉民

（吉林大學第二醫(yī)院骨科，吉林長春130041）

目的探討PLA－PTMC／GDNF復合導管對脊髓損傷功能恢復的影響。方法我們采用RT－PCR的方法對GAP－43的mRNA表達進行分析，從基因水平上來檢測植入PLA－PTMC／GDNF復合導管與其他治療組GAP－43基因表達上的差異。結果術后第2周時，A組、B組、C組和D組的GAP－43mRNA相對表達水平與正常組相比明顯增高；術后4周時，B組和D組的GAP43mRNA表達與第2周時相比明顯增高，與A組和C組相比明顯增高，有顯著性差異；術后6周時，D組的GAP－43mRNA表達仍明顯增高，與A組、B組和C組相比增高有顯著性差異；第8周時各組GAP－43mRNA表達均有所下降，但D組的GAP－43mRNA相對表達水平與A組、B組和C組相比仍高，有顯著性差異。結論PLA－PTMC／GDNF復合導管更有利于軸突再生的修復連接和脊髓損傷的功能恢復。

脊髓損傷；聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯；GAP－43mRNA；導管移植

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0198）

中樞神經系統(tǒng)的神經組織再生更具有挑戰(zhàn)性，目前的治療方法大都不能有效的充分恢復中樞神經系統(tǒng)的神經功能。為此我們研究聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯（PLA－PTMC）聯合GDNF的復合導管對大鼠脊髓損傷修復作用并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

健康Wistar雌性大鼠，體重220－260g，隨機分成為：正常對照組、完全脊髓橫斷組（A組）和治療組，治療組又按治療方法的不同分為3組，即單一應用GDNF組（B組），單一應用PLA－PTMC導管植入組（C組），應用PLA－PTMC／GDNF復合導管植入組（D組）。每組實驗動物9只，實驗過程中，動物模型出現死亡，分析原因并改正，及時補充，并做標計，按照實驗設計延時完成各項指標的評估。

1.2 PLA－PTMC／GDNF復合導管的制備

稱取適量PLA－PTMC溶于乙酸乙酯中，加入GDNF凍干粉，超聲分散法充分混勻。制成每根導管含GDNF 400U的PLA－PTMC／GDNF復合導管數根。

PLA－PTMC導管由濟南健寶開元生物材料有限公司研究中心提供。GDNF由RD公司提供。

1.3 PCR引物

GAP－43引物根據GenBank所載大鼠GAP43的mRNA序列解設計，兩條引物序列分別為：上游為5′－AGGGAGATGGCTCTGCTACT－3′，下游5′TCTTTACCCTCATCCTGTCG3′。基因擴增產物長度為406bp。

β－actin引物序列為上游：5′GAAATCGTGCGTGACATTAA3′，下游：5′CTAGAAGCATTTGCGGTGCA3′。基因擴增產物長度為511 bp。

以上引物均由賽百盛基因技術有限公司合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 將大鼠用10%水合氯醛（0.25ml／100g體重）腹腔注射麻醉，腰背手術區(qū)3.0cm×1.5cm剃毛，常規(guī)碘氟消毒，按肋骨確定椎體序列，縱向剪開皮膚，切口長約2.5cm。分離深筋膜及椎旁肌，顯露出T9－T11錐體的椎板和棘突，直至關節(jié)突，用蚊式止血鉗小心去除其棘突、椎板至關節(jié)突內側面，暴露出脊髓硬脊膜，切開硬脊膜，用眼科剪橫斷脊髓，負壓吸引出少許斷端脊髓組織，使脊髓斷端形成4 mm間隙，確保完全斷裂。A組造模后直接關閉創(chuàng)口。B組脊髓完全橫斷后將裝入GDNF的微型泵安置于皮下，此泵通過聚乙烯導管直接導入脊髓離斷處，應用微型泵泵入GDNF溶液（2mg／ml），0.5 μl／h，持續(xù)3周。C組于脊髓損傷區(qū)移植PLA－PTMC導管。D組于脊髓損傷區(qū)移植PLA－PTMC／GDNF復合導管，導管由切口下端向上端植入脊髓斷端間，用10－0無損傷線縫合硬脊膜。明膠海綿完全止血后，局部撒青霉素粉末2×105U，逐層縫合肌肉、深筋膜、皮膚，再次消毒。各組橋接方法完全相同。術后實行分籠飼養(yǎng)。正常對照組，不經手術處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.2 半定量RT－PCR按試劑盒說明操作。取1 μl提取的RNA原液加299μl三蒸水，充分混勻，以三蒸水調零，紫外分光光度記檢測各組標本RNA在260nm、280nm處的光吸收值，按下列公式計算RNA的濃度及純度。

RNA的濃度：RNA（μg／μl）＝OD260×40×300（稀釋倍數）×1000

RNA純度檢測標準：OD260／OD280＝1.8－2.0。定量后，取各組標本的總RNA各1μl在1%的瓊脂糖凝膠以90V電壓做穩(wěn)壓電泳，通過檢測28S及18SRNA的亮度比值也對所提取的垂體的總RNA做完整度的檢測。

1.4.3 RT－PCR擴增產物的鑒定與定量分析 取20μl PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，0.5%溴化乙錠染色20min。用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)（EDAS）進行電泳結果的拍照及電泳條帶的強度分析，分別計算各組樣品的目的基因擴增產物與內參照β－actin擴增產物的灰度比值來表示該目的基因的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗數據均以（ˉx±s）表示，采用LSD（Leastsignificant difference）法進行兩兩間比較。由SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RNA的質量檢測

提取的RNA做1.0%的瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，28S和18SrRNA的兩條帶均明顯可見，且28S和18SrRNA兩條帶的強度之比大約為2，說明RNA完整性好，降解很少。

圖1 RNA的質量檢測

2.2 各組大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析

各實驗組大鼠脊髓損傷區(qū)及正常對照組脊髓GAP－43mRNA相對表達水平比較見表1。術后第2周時，A組、B組、C組和D組的GAP－43mRNA相對表達水平與正常組相比明顯增高，P＜0.05，A組、B組、C組和D組各組間GAP－43的mRNA相對表達水平無顯著性差異；術后4周時，B組和D組的GAP43mRNA表達與第2周時相比明顯增高，P＜0.05，與A組和C組相比明顯增高，有顯著性差異，P＜0.05；術后6周時，D組的GAP－43mRNA表達仍明顯增高，與第4周時相比明顯增高，P＜0.05，與A組、B組和C組相比增高有顯著性差異，P＜0.05；第8周時各組GAP－43mRNA表達均有所下降，但D組的GAP－43mRNA相對表達水平與A組、B組和C組相比仍高，有顯著性差異，P＜0.05（見圖2）。

表1 各實驗組大鼠脊髓損傷區(qū)及正常對照組脊髓GAP－43mRNA相對表達水平的比較（n＝3，ˉx±s）

圖2 各組大鼠脊髓組織中GAP－43及β－actin基因擴增產物電泳圖

3 討論

組織工程學中一種普遍的方法是模擬天然的細胞外基質結構。在所有研究中，都出現了生物合成物，盡管沒有徹底的改變合成聚合物支架的降解速率和機械行為，但其對于促進神經細胞增殖與神經元延伸方面很有重要意義。這些材料同樣可在生物體外應用于促進神經再生。制成人造移植物可以使其理化特性更適合于臨床應用。PLA－PTMC能進行生物降解，并且不會引起排斥反應，還可以減少免疫反應的發(fā)生。為了更好的了解其在脊髓損傷修復機制，了解修復過程中脊髓組織分子水平的變化是很必要的，在此我們集中關注GAP－43，因其在脊髓損傷修復中多次被提及，其在神經系統(tǒng)發(fā)展、軸突再生、突觸功能的形成起很重要的作用，其表達的顯著與否用量化來描述，基于此目的我們采用RT－PCR法觀察各組大鼠脊髓損傷區(qū)其量化的變化［1－3］。GAP－43是一種磷酸蛋白質，被認為是神經再生的相關蛋白質和關鍵因子，具有促進神經軸突生長發(fā)芽和突觸連接形成作用，在神經系統(tǒng)發(fā)育、生長及創(chuàng)傷修復過程中可發(fā)揮重要作用。其是神經組織特有的生長相關蛋白，廣泛分布于神經元、部分胚胎、再生的雪旺細胞和神經膠質細胞，在神經細胞中又以生長的神經纖維末端含量豐富［4］。它與軸突的生長密切相關。在神經元發(fā)育和再生中，是神經重塑和再生標志，最具有代表性，應用普遍［5］。它以快速軸突轉運的方式從胞體到未梢，在生長過程中GAP－43選擇性表達，它的軸突轉運和合成在軸突再生和突觸再生時高度的表達，而在突觸形成后又會下降。本實驗通過RT－PCR法分別檢測術后2周、4周、6周和8周GAP－43在各組動物模型中的表達，觀察PLA－PTMC／GDNF復合導管移植后大鼠脊髓GAP－43mRNA表達及功能恢復情況。本實驗各組大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，術后2周時，完全脊髓損傷組（A組）、單一應用GDNF（B組）、單一應用PLA－PTMC植入組（C組）、復合導管組（D組）的GAP43mRNA表達均增加，與正常對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），A－D各組間相比無顯著性差異（P＞0.05），這表明雖然各組行為學評分這時得分較低，但軸突已開始有再生。術后4周時，D組與B組的GAP－43 mRNA表達相比無顯著性差異（P＞0.05），但D組和B組分別與A組和C組相比增高明顯，有顯著性差異（P＞0.05），表明軸突再生較多。術后6周時，D組與A組、B組、C組的GAP－43mRNA表達相比增高明顯，D組6周時與其4周時相比明顯增高（P＜0.05），表明此時間點神經再生最活躍；8周時，AD組的GAP43mRNA表達較6周時下降，表明神經再生趨于穩(wěn)定，D組的GAP－43mRNA表達與正常對照組及A－C組相仍增高（P＜0.05）。從上述GAP－43mRNA表達變化來看，雖在術后第4周時D組與B組相比差別無統(tǒng)計學意義，但在術后第4周、6周和第8周時D組與其它各脊髓損傷組（A組、B組、C組）的GAP－43mRNA表達均增高明顯，且有統(tǒng)計學意義。而其他各脊髓損傷組各周GAP43 mRNA表達變化幅度不明顯或僅有一個時間點上有明顯改變。結果顯示GDNF同PLA－PTMC導管二者協同作用能更為顯著的促進中樞神經系統(tǒng)的神經再生。

綜上所述，神經再生是一個復雜的過程，并具有挑戰(zhàn)性的研究領域。在過去幾十年的有關脊髓神經功能恢復的進展成果令人印象深刻。本實驗為治療SCI提供了一個新的方法，如果在本實驗的基礎上，進一步測試神經通過的成功率并改進PLA－PTMC／GDNF復合導管的性能，可進一步開展PLA－PTMC／GDNF復合導管治療SCI的亞臨床研究，為SCI的再生修復治療帶來了新的希望。

［1］Bock P，Spitzbarth I，Haist V，et al.Spatio－temporal development of axonopathy in canine intervertebral disc disease as a translational large animal model for nonexperimental spinal cord injury［J］.Brain Pathol，2013，23（1）：82.

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［3］Fumagalli F，Madaschi L，Caffino L，et al.Acute spinal cord injury reduces brain derived neurotrohic factor expression in rat hippocampus［J］.Neuroscience.2009，159（3）：936.

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［5］Maier DL，Mani S，Donovan SL，et al.Disrupted cortical map and absence of cortical barrels in growth－associated protein（GAP）－43 knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（16）：93.

The influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the protein expression of GAP－43 mRNA in spinal cord injury of rats

SHAO Guo－xi，JIAO Jing－xue，LIU Qin－yi，et al.（The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the mRNA expression of GAP－43in spinal cord injury of rats.MethodsTo explore the mRNA expression of GAP－43at molecular biological level with RTPCR to make certain the difference between PLA－PTMC／GDNF and others.ResultsA，B，C，D groups showed high protein expression at 2weeks，and there is no significant difference among these groups.B，D groups had significant higher expression at 4weeks than that of two weeks.D group showed high protein expression at 6weeks than other groups and all groups showed higher expression.At 8weeks，all groups showed lower expression of GAP－43mRNA，but D group showed more expression than others.ConclusionPLA－Poly－PTMC／GDNF is more helpful for axon regeneration spinal cord recovery.

Spinal cord injury；PLA－poly trimethylene carbonate；glial cell line－derived neurotrophic factor；catheter implantation

R744

A

2014－07－30）

1007－4287（2015）02－0198－04

吉林省科技廳國際合作課題資助（20120721）

＊通訊作者