TGFβ1誘導的肝臟前體細胞上皮-間質轉換在逆轉過程中可影響星狀細胞活化

趙文姍 楊愛婷 孫亞朦 賈繼東 尤紅

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化是肝纖維化發生、發展的主要因素［1］。當慢性肝損傷時，肝細胞再生受到抑制，此時肝臟前體細胞(hepatic progenitor cells，HPC)可被激活，通過分化成肝細胞和膽管細胞對肝臟損傷產生應答并進行修復［2-3］。

Lorizini等［4］發現，在大鼠或小鼠肝臟受損模型和人類慢性乙型肝炎、丙型肝炎纖維化組織中，激活的HPC常與肝HSC伴行。經TGFβ1刺激后的HPC在與HSC利用Transwell間接共培養時，可影響HSC的活化。其中，TGFβ1在體外培養中可誘導HPC發生上皮-間 質 轉 換 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)［5］。而用HPC的條件培養基培養HSC時，則不能活化HSC。因此，前體細胞是否只有在TGFβ1升高的情況下才會對HSC發揮作用，尚不清楚。

本研究使用大鼠肝臟WB-F344和HSC-T6細胞系作為HPC和HSC體外研究的模型，通過條件培養基體系，觀察HPC經TGFβ1刺激后，其條件培養基對HSC活化及細胞外基質的影響。

材料和方法

一、主要材料

大鼠肝臟前體細胞系WB-F344由軍事醫學院裴雪濤教授贈送，大鼠肝星狀細胞(T6)系由美國紐約西奈山醫學院Friedman教授贈送。DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司。TGFβ1購自PeproTech公司(100-21C)。反轉錄PCR試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Green實時熒光定量PCR試劑購自美國ABI公司。引物序列由北京賽百盛基因技術有限公司合成。大鼠Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ)酶聯免疫分析試劑盒(Rat0513)購自美國 Andy Gene公司。Western印跡所用的第一抗體詳見表1，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物公司。

表1 Western印跡抗體及條件

二、方法

(一)條件培養基間接共培養體系的建立

前體細胞復蘇后用含 10%FBS的 DMEM(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)，于 37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。取對數生長期的前體細胞，消化后制備成單細胞懸液，根據需要以適當密度接種于100 mm細胞培養皿，培養24 h。待細胞貼壁后棄去舊培養基，換成TGFβ1濃度為10 ng/mL的10%FBS的 DMEM 培養基培養 6、12、24、36或48 h。棄掉含 TGFβ1培養基，PBS洗細胞一次，換含10%FBS的DMEM培養基繼續培養48 h，收集上清液及細胞，提取細胞總蛋白，并以不加任何處理因素為對照組。

同取對數生長期的HSC細胞，以每皿5×105個接種于100 mm細胞培養皿，培養24 h。棄去舊培養基，換上述收集的條件培養基，繼續培養48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白及RNA。

(二)HSC及前體細胞總蛋白的提取及Western印跡

將上述收集的HSC及前體細胞，予以蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，利用BCA蛋白質定量試劑盒對蛋白質進行定量后，每組取30 μg總蛋白上樣。12%SDS-PAGE分離蛋白質，濕轉恒流390 mA 55 min，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入α-SMA及TIMP-1的一抗，4℃孵育過夜，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗(1∶8 000稀釋)和山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育l h，充分洗滌后發光、顯影、定影、曝光及掃描。內參對照β-actin用洗膜液于室溫孵育40 min洗膜后重新封閉，加入β-actin一抗和相應二抗孵育。

(三)HSC-T6細胞總mRNA的提取及實時熒光定量PCR

按照Trizol Reagent試劑盒說明書的步驟提取細胞總mRNA，按照Promega公司反轉錄試劑盒說明書的步驟將4 μg mRNA 反轉錄，得到50 μL cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中相應指標的變化，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照。引物序列見表2。DNA序列由北京賽百盛基因技術有限公司合成。實時熒光定量PCR反應條件:95℃ 10 min;94℃ 15 s，60℃ 60 s，循環40 次。

表2 實時PCR引物序列

(四)ELISA法檢測條件培養基中Col-Ⅰ的含量

按照ELISA試劑盒說明書的步驟檢測上述所收集的條件培養基中Col-Ⅰ的含量。經過加樣、溫育、配液、加酶、洗滌、顯色及終止反應等步驟后，用酶標儀450 nm讀數，測定各孔A值。以A值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據上清液的A值計算出其濃度。

六、統計學方法

采用SPSS 16.0軟件行單因素方差分析，數據以均數±標準差表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、TGFβ1對肝臟前體細胞形態學的影響

利用 TGFβ1(10 ng/mL)刺激 HPC 6、12、24、36 及48 h，以新鮮培養基培養相應時間點的細胞作為對照組，倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化。結果TGFβ1刺激后細胞明顯變大變圓，胞質比例明顯增加，核質比減少。隨著TGFβ1藥物作用時間的增加，上述變化更為明顯(見圖1)。

二、去除TGFβ1刺激后，其誘導的EMT可逆轉

用TGFβ1刺激前體細胞不同時間點后，棄掉上清液，換新鮮培養基再培養48 h(見圖2A)。發現短期刺激后前體細胞表現為間質細胞特點，主要表現為間質細胞標志物α-SMA的表達升高，6 h及12 h分別為對照組的2.2 倍(P=0.01)及 2.62 倍(P=0.28);隨著刺激超過24 h，與對照組相比，α-SMA的表達無明顯變化，24、36及 48 h分別為對照組的 1.31倍(P ＞0.05)、0.97 倍(P=0.027)及 1.08 倍(P=0.058)。(見圖 2B)。

三、條件培養基間接共培養未能改變HSC細胞形態

將培養過TGFβ1預刺激后的前體細胞48h的培養基收集、離心、過濾后作用于HSC，以培養過未經處理前體細胞的條件培養基作為對照組，使用普通倒置顯微鏡觀察各組HSC細胞形態(見圖3)。TGFβ1預刺激后的條件培養組的HSC細胞形態與對照組無差別，各組細胞呈梭形。

圖1 TGFβ1作用于HPC不同時間點后，前體細胞形態學發生明顯變化(倒置顯微鏡×10)

圖2 去除TGFβ1刺激后，其誘導的前體細胞上皮-間充質轉換可發生逆轉

圖3 TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養基未能改變HSC細胞形態倒置顯微鏡(×10)

四、條件培養基對HSC細胞活化及細胞外基質的作用

與未經處理的WB-F344細胞條件培養基相比，TGFβ1刺激6h后的WB-F344細胞條件培養基能夠促使HSC活化指標α-SMA和細胞外基質指標TIMP-1在蛋白水平表達升高;這兩個指標在基因水平上也呈升高趨勢，分別升高4.12倍(P=0.008)及 2.64倍(見圖4A、4B)。然而，經TGFβ1刺激24 h后的條件培養基培養后上述作用相反，主要表現為:α-SMA的蛋白表達降低，而TIMP-1的表達無明顯變化;α-SMA和TIMP-1基因水平變化分別為，24 h為對照組0.81 倍及0.98 倍，36 h為0.96 倍及0.61 倍，48 h為0.63倍及0.76倍(見圖4B)，呈降低趨勢。

圖4 TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養基，對HSC細胞活化及細胞外基質表達的變化

五、TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養基中Col-Ⅰ的表達無顯著變化

我們用酶聯免疫分析試劑盒檢測所收集的條件培養基中Col-Ⅰ的含量，結果顯示，TGFβ1刺激后的前體細胞條件培養基中Col-Ⅰ的含量，與未經處理的條件培養基相比并無明顯差異(P＞0.05)(見圖5)。這說明，條件培養基對HSC活化及細胞外基質產生的作用可能與Col-Ⅰ的分泌無關。

圖5 TGFβ1刺激WB-F344后的條件培養基中Col-Ⅰ的表達量并無明顯變化

討 論

慢性肝損傷時，HPC與HSC的密切聯系使得人們越來越關注HPC能否通過調控HSC進而影響肝纖維的進展。本研究采用前體細胞體外模型WB-F344細胞株，其在不同誘導劑的作用下，能夠分化為成熟的肝臟細胞和膽管上皮細胞［7］。

細胞共培養技術可模擬體內生成的微環境，便于更好的觀察細胞與細胞、細胞與培養環境之間的相互作用以及探討藥物的作用機制和可能作用的靶點。Lin等［8］發現通過Transwell小室共培養體系，人多能間充質干細胞分泌的神經生長因子可促進HSC的凋亡并抑制增殖，進而起到抗肝纖維化的作用。既往研究顯示，經 TGFβ1刺激后的 HPC在與 HSC利用Transwell間接共培養時，可影響HSC的活化。TGFβ1是經典的致纖維化誘導劑，慢性肝損傷時可升高。

本研究發現，前體細胞在去除TGFβ1刺激后，其間質細胞標志物的表達可逐漸下降，這在一定程度上說明前體細胞EMT發生了逆轉。這可能與所換的新鮮培養基中FBS有關，因為FBS中含有的EGF可能促進了這一過程［6］。在EMT的逆轉過程中，其條件培養基又能夠對HSC的活化發揮作用。當TGFβ1刺激前體細胞的時間相對較短，其條件培養基可促進HSC的活化;而當逐漸增加刺激時間時，條件培養基反過來會抑制HSC的活化。這可能與前體細胞的狀態有關，前體細胞接受到外界損傷信號時，如果刺激輕微或時間較短，其并不能發揮損傷修復的作用，從而刺激HSC的活化;而當刺激足夠強或時間長時，前體細胞才能啟動損傷修復機制，進而抑制HSC的活化。本研究為進一步探討HPC和HSC之間的相互作用以及治療肝纖維化提供了一定的實驗室基礎，但前體細胞逆轉過程中分泌的某種因子或通過某種基質作用于HSC仍需進一步研究。

1 Sprenger H，Kaufmann S，Garn H，et al.Induction of neutropilattracting chemokinesin transforming rathepatic stellate cells.Gastroenterology，1997，113:277-285.

2 Dan YY，Riehle KJ，Lazaro C，et al.Isolation of multipotent progenitor cells from human fetal liver capable of differentiating into liver and mesenchymal lineages.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:9912-9917.

3 Williams MJ，Clouston AD，Forbes SJ.Links between hepatic fibrosis，ductular reaction，and progenitor cell expansion.Gastroenterology，2014，146:349-356.

4 Lorenzini S， Bird TG， Boulter L， et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.Gut，2010，59:645-654.

5 Wang P，Liu T，Cong M，Wu X，Bai Y，Yin C，An W，et al.Expression of extracellular matrix genes in cultured hepatic oval cells:an origin of hepatic stellate cells through transforming growth factor beta Liver Int，2009，29:575-584.

6 Sam R，Wanna L，Gudehithlu KP，Garber SL，Dunea G，Arruda JA，Singh AK.Glomerular epithelial cells transform to myofibroblasts:early but not late removal of TGF-beta1 reverses transformation.Transl Res，2006，148:142-148.

7 Couchie D，Holic N，Chobert MN，et al.In vitro differentiation of WBF344 rat liver epithelial cells into the biliary lineage.Differentiation，2002，69:209-215.

8 Lin N，Hu K，Chen S，et al.Nerve growth factor-mediated paracrine regulation of hepatic stellate cells by multipotent mesenchymal stromal cells.Life Sci，2009，85:291-295.