解毒化濁方對胰島素抵抗大鼠GLUT4m RNA表達的影響*

楊維杰，康學東，朱 瑾，余臣祖，王苑銘，安小平，張瀚文

甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

解毒化濁方對胰島素抵抗大鼠GLUT4m RNA表達的影響*

楊維杰，康學東△，朱 瑾，余臣祖，王苑銘，安小平，張瀚文

甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

目的：探討解毒化濁方對胰島素抵抗大鼠葡萄糖轉運4(glucose transporter 4,GLUT4)表達的影響及其治療胰島素抵抗的作用機理。方法：將雄性wistar大鼠48只隨機選出12只設為空白組，采用生理鹽水灌胃，其余大鼠采用高脂飼料喂養方法造胰島素抵抗大鼠模型后，隨機分為模型組、解毒化濁治療組及羅格列酮治療組，每組12只，解毒化濁組以解毒化濁方混懸液2.025g/（kg·d）灌胃，羅格列酮組以羅格列酮混懸液0.36mg/（kg·d）灌胃，模型組與空白對照組均予等體積生理鹽水灌胃。治療10周后檢測大鼠空腹血糖（FBG）、糖耐量試驗（2 h血糖）［OGTT（2hPG）］、空腹胰島素(FINS)水平，并應用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測各組大鼠骨骼肌組織GLUT4 mRNA的水平。結果：解毒化濁方與羅格列酮均能降低大鼠FBG、2hPG及FINS水平，差異有統計學意義（P＜0.05），在降低體質量方面與空白組比較解毒化濁組及羅格列酮組差異有統計學意義（P＜0.05）；解毒化濁組與羅格列酮組大鼠血清FBG、2hPG、FINS比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠GLUT4表達水平呈低表達（P＜0.05）；與模型組比較，解毒化濁組與羅格列酮組大鼠GLUT4表達水平顯著增加（P＜0.05）。結論：解毒化濁方可降低胰島素抵抗大鼠血清FBG、OGTT（2hPG）及FINS水平，增加骨骼肌組織中GLUT4的表達，提高胰島素敏感性，有改善胰島素抵抗的作用。

胰島素抵抗；解毒化濁方；激酶葡萄糖轉運子4

胰島素抵抗（In su l in R e s i s tan c e，I R）是指胰島素作用的靶器官、組織(主要肝臟、骨骼肌、脂肪組織)對胰島素敏感性降低的一種異常狀態，即需要高于正常劑量的胰島素才能產生正常的生理效應。研究表明，I R是一種重要病理生理變化，不僅是肥胖、糖尿病、高血壓、動脈硬化性心血管疾病、脂質代謝異常等的共同危險因素[1]，而且還與妊娠、腫瘤、感染、應激等多種生理或病理有著密切關系。隨著人民生活水平的提高、飲食結構及生活方式的改變，長期高脂飲食使得肥胖的發病率增高，而因肥胖引起胰島素抵抗的患病率日趨增高。長期高脂環境能損害包括骨骼肌、肝臟和脂肪在內的多種胰島素靶器官的胰島素敏感性。因此，高脂飲食已成為誘發胰島素抵抗(I R)的獨立危險因素之一[2]。近幾年胰島素抵抗的研究已經成為國際學術界研究的焦點。因此，本研究擬觀察解毒化濁方對胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織胰島素信號通路中G L U T4表達的影響，探討其治療胰島素抵抗的作用機理，為中醫藥防治胰島素抵抗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由甘肅中醫藥大學實驗中心S P F級動物實驗室提供S P F級W i s tar大鼠48只［4月齡，體質量（200±20）g，雄性］；動物實驗使用證號：S YX K(甘)2011-0001-0000407；實驗動物合格證號：S C X K(甘)2011-0001-0001365。予普通飼料適應性喂養1周。

1.1.2 實驗藥物與試劑 普通飼料為S P F級大鼠普通飼料，由甘肅中醫學院S P F動物實驗中心提供；高脂飼料配方比例為（豬油10%∶膽固醇2%∶膽酸鹽0.5%∶蔗糖20%∶普通飼料67.5%），由北京科澳協力飼料有限公司定制；大鼠血清胰島素檢測試劑盒（R at I N S EL IS A K it，甘肅寶信生物技術公司提供）；D EPC（天津鼎天生物科技有限公司，Si g ma分裝，批號：D5758）；S Y B R G reen（瑞士羅氏公司）；R na s e-f ree水（北京百泰克生物科技有限公司）；高純總R N A快速提取試劑盒、熒光實時定量PC R試劑盒及反轉錄試劑盒均購自日本T a k ara中國寶生物工程（大連）有限公司，產品代碼分別為 S D1410、RR036、RR820A；引物合成［大鼠G L U T4基因的特異性引物序列由日本T a k ara中國寶生物工程（大連）］有限公司設計并合成；解毒化濁方藥物組成：黃連、黃柏、雞內金、山楂、枳殼、丹參，按一定比例配伍而成，用水提法提取，濃縮、干燥、制粒。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立與分組 將48只雄性W i star大鼠適應性喂養1周后，隨機分為2組，即空白組12只、造模組36只，造模組采用高脂飼料喂養4周的方法造模，空白組給予普通飼料，4周后通過測定大鼠體質量、空腹血糖、糖耐量試驗（O G TT）2 h血糖、胰島素敏感性｛ISI：ln[1/(F B G× I N S)]｝[3]將造模成功大鼠隨機分為模型組、解毒化濁組及羅格列酮組，解毒化濁組以解毒化濁方混懸液2.025 g/（k g·d）灌胃；羅格列酮組以羅格列酮混懸液0.36m g/（k g·d）灌胃，模型組與空白組均予等體積的生理鹽水灌胃。每組持續給藥10周。

1.2.2 實驗指標檢測 10w后禁食12 h，空腹稱重；同時檢測大鼠尾靜脈空腹血糖（F B G）、O G TT（2 h）血糖；O G TT檢測結束后所有大鼠按劑量3 m L/k g用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血，測空腹血清胰島素(F I N S)，計算胰島素敏感性(ISI)；并取一側后肢骨骼肌，裝入凍存管中，迅速凍存于液氮中，24 h后置于-80℃低溫冰箱保存；之后用R T-PC R技術檢測胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織G L U T4 m R N A表達。T ri z ol試劑提取骨骼肌總R N A，行完整性和純度鑒定，并依A260值進行定量。引物序列如下：G L U T4上游引物為5′-TT G C A G TG CC T G A G T C TT C TT-3′，下游引物為5′-AT C A C TTT C TG T GGGG C G TT-3′，應用C F X96 R eal-T ime PC R擴增儀，引物濃度為 20μmol/L，常規方法反轉錄。實時定量PC R體系：5×S Y B R G reen b uf f er10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，25mmol/L d N T P s 0.5μL，2 U/L T a q酶 1.5μL，cD N A模板 5μL，dd H2O32μL。條件：93℃3min，1個循環；93℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，40個循環，于每循環延伸反應最后時刻收集熒光信號。

1.3 統計學方法 采用S P SS 19.0統計學分析軟件對數據進行處理，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，治療前后比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 空白組大鼠精神狀態良好，活動靈敏，體表皮毛光滑，食欲及尿量均正常，未出現大鼠死亡；造模組大鼠隨著實驗的進程逐漸出現皮毛發黃，毛色粗糙、失去光澤，活動減少，喜臥少動，飲水量和尿量均有增加，后期大鼠精神明顯變差，出現精神萎靡，反應遲鈍，行動遲緩，皮毛粗糙明顯，其中2只大鼠死亡，6只大鼠未達標。藥物治療后以上癥狀均有不同程度的好轉和改善。其中解毒化濁組有1只大鼠死亡，模型組3只大鼠死亡。

2.2 造模前后各組大鼠體質量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平的變化情況 造模4周后，與空白組相比，造模組大鼠體質量、F B G、2h P G水平均有升高，ISI顯著下降，其差異有統計學意義（P＜0.05），表明造模成功，見表1。

表1 造模前后各組大鼠體質量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平變化比較

2.3 治療前后各組大鼠體質量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS水平變化情況 藥物治療10周后，與模型組相比，解毒化濁方與羅格列酮均能降低大鼠F B G、2h P G及F I N S水平，升高ISI，其差異有統計學意義（P＜0.05）；在降低體質量方面與空白組比較解毒化濁組與羅格列酮組差異有統計學意義（P＜0.05）。解毒化濁組與羅格列酮組大鼠血清F B G、2h P G、F I N S比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 治療前后各組大鼠體質量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS、ISI水平變化比較

2.4 各組大鼠骨骼肌中GLUT4表達水平的變化情況 與空白組比較，模型組大鼠G L U T4m R N A的表達水平呈低表達（P＜0.05）；與模型組比較，解毒化濁組與羅格列酮組大鼠G L U T4m R N A的表達水平均較模型組顯著增加（P＜0.05）；解毒化濁組與羅格列酮組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌中GLUT4mRNA表達水平變化比較

3 討論

3.1 解毒化濁方的作用 解毒化濁方是從事臨床工作多年，具有豐富治療經驗的康學東教授在孫思邈《千金方》的啟發下，依據胰島素抵抗患者中肥胖者居多組方而來［4］。治則為化濁去痰，清熱解毒。解毒化濁方為純中藥制劑，為甘肅中醫學院附屬醫院的院內制劑，方中黃連、黃柏，味苦、性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，兩藥善清中、下焦濕熱，故為君藥。現代藥理研究證明黃連的主要成分為小檗堿，而小檗堿有降低血清抵抗素，改善胰島素敏感性的作用[5]；黃柏含有小檗堿，研究顯示黃柏提取物(P55A)丁醇提取物能通過激活E R K2及P I3-激酶，促進肝糖原合成，調節血糖濃度[6]；山楂，味酸甘，性微溫，無毒，歸脾、胃、肝三經，具消食化積、行氣散瘀的作用；雞內金味甘平，入脾、胃、小腸、膀胱經，具有消食健胃、澀精止遺的作用，二藥合用可助黃連、黃柏清熱、解毒、化濁之功，共為臣藥；山楂和雞內金均有甘油三酯和減少肝及腸系膜中脂肪堆積的作用[7]；枳殼味苦酸、性微寒，具有行氣、化痰、消積的功效，可消心下痞塞之痰，泄腹中滯寒之氣，推胃中隔宿之食，消腹中連年之積，為佐藥[8]；丹參味苦，微寒，具有活血祛瘀的作用，為使藥。諸藥合用，共奏行氣化痰、健脾消積、化濕祛瘀之功。上述藥物均可降低血糖，調節血脂，達到肥胖患者的胰島素抵抗。

3.2 骨骼肌組織GLUT4的表達在T2DM中的作用 G L U T4是葡萄糖轉運蛋白家族(G L U Ts)的成員之一，是一種分子量45-55k D，含509個氨基酸單一多肽鏈的糖蛋白，基本結構由l2個跨膜片斷鈦鏈相連[9]。以往認為G L U T4主要存在于骨胳肌、心肌及脂肪組織中。最新研究表明，G L U T4還存在于其他組織細胞中，如初生Balb/c鼠腦組織、馬薄片狀角化細胞、人和鼠胰島組織細胞、人子宮內膜細胞和早期人胎盤合體滋養層，并有可能發揮著獨特作用。G L U T4的主要功能是在肌肉和脂肪組織中轉運葡萄糖。在無刺激時，90%以上的G L U T4分布于細胞內，如微粒體、高爾基復合體、管型囊等囊泡樣結構中，這些囊泡樣結構稱作G L U T4儲存囊泡（G S V s）。在胰島素刺激或運動刺激下，脂肪細胞和骨骼肌細胞中的G L U T4會從細胞內轉位至細胞膜上，發揮其轉運葡萄糖進入細胞內的生理作用[10]。目前已進一步證實骨骼肌細胞外膜G L U T4的含量與細胞最大葡萄糖轉運能力呈正相關，葡萄糖的跨膜轉運是骨骼肌細胞利用葡萄糖的主要限速過程。胰島素刺激的靶組織對葡萄糖的轉運在胰島素抵抗的發病機制中起主導作用。由于G L U T4介導的葡萄糖轉運是外周組織葡萄糖利用的限速步驟，因此，有關G L U T4與胰島素抵抗之間的研究具有重要意義。

本研究依據該信號通路在血糖調節與代謝環節中所起的作用，采用解毒化濁中藥干預胰島素抵抗大鼠，通過檢測G L U T4在骨骼肌的表達，從分子水平驗證解毒化濁中藥改善I R、降糖、提高胰島素敏感性的作用。

[1] 葛均波，徐永健.內科學[M].8版.北京:人民衛生出版社，2013：746-747.

[2] 陳家倫.臨床內分泌學[M].上海：上海科學技術出版社，2011: 1250.

[3] Haf fner SM,Kennedy E，Gonzalez C,et al.A prospective analysis of the HOMA model:the mexico city diabetes study[J].Diabetes Care,1996,19（10）:1138-1141.

[4] 康學東，余臣祖.化濁顆粒對非酒精性脂肪肝大鼠血脂代謝的影響[J].中醫雜志，2011，52（24）：2125-2127.

[5] 丁來標，陸付耳，葉愛麗，等.黃連解毒湯對胰島素抵抗大鼠瘦素和抵抗素的影響[J].中國中西醫結合雜志，2006，26(3): 232-235.

[6] 李宗友.黃柏和遼寧楤木的丁醇提取物刺激PI3-激酶和ERK2引起的Hepɑ2細胞中糖原含量的增加[J].國外醫學：中醫中藥分冊，1999，21(3):44.

[7] 馬云，董小英，劉四春，等.金櫻子和雞內金對飼高糖高脂兔腹部脂肪及血糖血脂的影響[J].現代中西醫結合雜志，2003，12(16):1703-1704.

[8] 舒尊鵬，胡書法，翟亞東，等.中藥枳殼化學成分及藥理作用研究[J].科技創新與應用，2012,7(17):8-9.

[9] Duval C,Mül ler M,Kersten S.PPARalpha and dysl ipidemia[J].Biochim Biophys Acta,2007,1771(8):961-971.

[10]Zhang Q,Xiao X,Feng K,et al.Berberine moderates glucose and l ipid metabol ism through mul tipathway mechanism[J].Evidence-Based Complementary and Al ternative Medicine,2010：1-10.

Effectsof JieDu HuaZhuo Prescription on the ExpressionsofGLUT 4m RNA of the Ratsw ith Insulin Resistance

YANGWeijie,KANG Xuedong△,ZHU Jin,YU Chenzu,WANG Yuanming,AN Xiaoping,ZHANG Hanwen
University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To explore the impactof JieDu HuaZhuo prescription on the expressionsof glucose transporter4(GLUT4)mRNA of the ratsw ith insulin resistance(IR).Methods:Twelve ratswere chosen from 48maleWistar ones,established as the blank group and accepted intragastric adm inistration of physiological saline,the rest rats were fed w ith high lipid fodder to prepare IR ratmodel and random ly divided into themodel group,the treatment group of JieDu HuaZhuo prescription and the treatmentgroup of rosiglitazone,12 rats each group,the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription received the lavageof JieDu HuaZhuo suspension in the concentration of2.025g/（kg·d）and the treatment group of rosiglitazone rosiglitazone suspension in the concentration of 0.36mg/（kg.d），themodel group and blank control group equivalent volumes of physiological saline lavage.To detect the levels of FBG, OGTT(2hPG)and FINS of the rats after treating for ten weeks,andmeasure the levels of GLUT4mRNA in skeletal muscles of the rats by RT-PCR.Results:JieDu HuaZhuo prescription and rosiglitazone could decrease the levels of FBG,2hPG and FINS of the rats,the difference showed statisticalmeaning(P＜0.05),the difference had statistical meaning in reducing body weightw ithin the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription(P＜0.05);the difference presented no statisticalmeaning in the levelsof FBG,2hPG and FINSbetween the treatmentgroups(P＞0.05);compared w ith the blank group,the levels of GLUT4 expressions in themodelgroup were low(P＜0.05);compared w ith themodel group,the expressions of GLUT4 in the treatment groups increased significantly(P＜0.05).Conclusion: JieDu HuaZhuo prescription could decrease the levelsof FBG,2hPG and FINSof IR rats,enhanceGLUT4 expressions in the skeletalmuscle and improve insulin sensitivity,therefore,to improve IR.

insulin resistance;JieDu HuaZhuo prescription;glucose transporter4

R587.1

A

1004-6852(2015)07-0008-04

2014-09-02

2012年甘肅省教育廳科研項目計劃（編號1206-06）。

楊維杰（1980—），男，碩士學位，主治醫師。研究方向：糖尿病及其并發癥的中西醫結合治療。

△通訊作者：康學東（1962—），男，主任醫師。研究方向：內分泌系統疾病的中西醫結合診治。