亞麻木酚素對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)和AKP活性的影響

李興勇，魏曉輝，李喜香，劉效栓，陳二林，楊海娟，吳國(guó)泰

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省第三人民醫(yī)院；

3蘭州市第一人民醫(yī)院；4甘肅省中醫(yī)院；5甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

亞麻木酚素對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)和AKP活性的影響

李興勇1,2，魏曉輝3，李喜香4，劉效栓4，陳二林4，楊海娟5，吳國(guó)泰5

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省第三人民醫(yī)院；

3蘭州市第一人民醫(yī)院；4甘肅省中醫(yī)院；5甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

目的：觀(guān)察亞麻木酚素（FLs）對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)和血清堿性磷酸酶（A K P）活性的影響。方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，F(xiàn)Ls高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余50只灌胃醋酸潑尼松［20 m g/(kg·d）]，連續(xù)7天。第8天灌胃維甲酸（80 m g/kg），1次/d，連續(xù)8天。第14天開(kāi)始，F(xiàn)Ls低、中、高劑量組大鼠分別灌胃0.05 g/kg、0.1 g/kg和0.2 g/kg的FLs混懸液，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃雌二醇1.5 m g/kg，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃蒸餾水（10 m L/kg），連續(xù)14天。觀(guān)察大鼠的一般狀態(tài)，檢測(cè)骨生物力學(xué)和A K P活性。結(jié)果：造模后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.05）；血清A K P活性升高；最大載荷(Pm ax)、最大彎矩(M m ax)和明顯降低（P＜0.05）；最大撓度(Lm ax)和骨應(yīng)變具有降低的趨勢(shì)。給藥后，與模型組比較，F(xiàn)Ls高劑量組A K P含量降低（P＜0.05）；FLs各劑量都可不同程度提高Pm ax，Lm ax，M m ax和骨應(yīng)變（P＜0.05）。結(jié)論：亞麻木酚素可以提高骨質(zhì)疏松大鼠血清A K P活性，并可提高Pm ax，Lm ax，M m ax和骨應(yīng)變，提示其對(duì)骨質(zhì)疏松有一定的對(duì)抗作用。

亞麻木酚素；骨質(zhì)疏松；堿性磷酸酶；骨生物力學(xué)

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀(guān)結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨代謝疾病，伴有骨脆性增加而易于發(fā)生骨折［1］。隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的加劇，骨質(zhì)疏松性骨折作為嚴(yán)重的并發(fā)癥，對(duì)老年人健康的影響，日益引起人們的重視。雌激素對(duì)骨代謝有著重要作用，目前研究表明，絕經(jīng)后雌激素水平迅速下降是婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松的直接誘因，雌激素缺乏與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病存在廣泛關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制尚不明了。亞麻木酚素與雌激素結(jié)構(gòu)十分相似，主要存在于亞麻籽中，又叫開(kāi)環(huán)異落葉松酚二葡萄糖苷［2］。相關(guān)研究認(rèn)為其對(duì)雌激素依賴(lài)性疾病骨質(zhì)疏松、乳腺癌、前列腺癌等有預(yù)防作用［3-5］。本研究采用醋酸潑尼松、維甲酸建立實(shí)驗(yàn)性大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀(guān)察亞麻木酚素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨最大載荷(Pmax)、最大撓度(Lmax)、最大彎矩(Mmax)、骨應(yīng)力(σ)和骨應(yīng)變及血清AKP活性的影響，探討其對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，60只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±2)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)SYXK(甘)2011-0001。SPF級(jí)飼料(由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)喂養(yǎng)，自由飲水，室溫(25±0.5)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，12小時(shí)燈光，12小時(shí)黑暗，適應(yīng)7天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 亞麻木酚素(提取物)，棕色粉末，水中大部分溶解，殘存少量水不溶性顆粒物(甘肅省中醫(yī)院藥劑科提供，口服，擬推薦臨床成人日用量為0.2 g)。醋酸潑尼松(浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：141126)；維甲酸(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：SN1114CA14)；戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號(hào)：153A)；堿性磷酸酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20150331)。

1.3 主要儀器 Nestorius電子天平(德國(guó)Nestorius公司提供)；XYJ-2低溫離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠(chǎng)提供)；P型陶瓷纖維美誠(chéng)馬弗爐(北京美誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司提供)；3300型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司提供)；AG-107A型自動(dòng)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(日本島津公司提供)；BX60-32FB3-F01型OLMPUS顯微鏡(奧林帕斯公司提供)；大恒細(xì)胞分析系統(tǒng)(中國(guó)大恒集團(tuán)有限公司提供)；日本櫻花SAKURA TISSUE-TEK TEC5組織包埋機(jī)(北京怡康勇佳科技有限責(zé)任公司提供)；日本櫻花SAKURA TISSUE-TEKVIP5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)(北京怡康勇佳科技有限責(zé)任公司提供)；RM2135石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司提供)。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組 60只SD大鼠，隨機(jī)分為6組：正常組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、亞麻木酚素(FLs)低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只，除正常組外其余各組灌胃醋酸潑尼松(20 mg/kg體質(zhì)量)，1次/d，連續(xù)7天，第8天灌胃維甲酸(80mg/kg體質(zhì)量)，1次/d，連續(xù)8天。

1.4.2 給藥 造模第14天，F(xiàn)Ls低、中、高劑量組大鼠灌胃亞麻木酚素(分別為0.05、0.1、0.2 g/kg，相當(dāng)于臨床成人日用量的7、14、28倍)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃雌二醇(1.5 mg/kg，相當(dāng)于臨床成人日用量的14倍)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等容量的蒸餾水，連續(xù)14天。

1.5 指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 體質(zhì)量 各組大鼠每3天稱(chēng)體質(zhì)量1次，觀(guān)察大鼠的運(yùn)動(dòng)、皮毛光澤、飲食等情況。

1.5.2 血清堿性磷酸酶(A K P)活性測(cè)定 末次給藥60分鐘后，麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，分離血清(低溫離心，3 500 r/min，10分鐘)，用比色法在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定AKP活性。血清AKP活力(金氏單位/100 mL)=測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×標(biāo)準(zhǔn)管含酚量(0.005 mg)×100 mL/0.05 mL。

1.5.3 骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 取左股骨進(jìn)行骨生物力學(xué)試驗(yàn)，計(jì)算Pmax、Lmax、Mmax、σ和骨應(yīng)變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(χ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，F(xiàn)Ls不同劑量組體質(zhì)量均有所增加。第4周和第5周，F(xiàn)Ls中劑量組與除正常組以外的其他的組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響(±s) g

表1 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響(±s) g

注：與正常組比較*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

組別 只數(shù) 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周正常組 10 195.96±15.64 205.16±16.50 224.51±21.71 228.91±21.47 234.62±25.92模型對(duì)照組 10 181.27±20.68 180.61±20.47*181.42±21.19*191.52±24.24**206.97±27.96*陽(yáng)性對(duì)照組 10 184.34±13.46 181.47±15.28 176.86±14.19 183.42±13.69 192.37±9.38 FLs高劑量組 10 184.44±19.82 183.83±21.38 182.69±22.44 191.17±23.44 209.24±24.06 FLs中劑量組 10 183.06±11.47 183.73±12.39 189.73±13.20 204.46±11.92#222.28±14.04#FLs低劑量組 10 177.90±14.91 173.78±12.16 177.59±15.21 189.79±13.09 201.10±14.15

2.2 FLs對(duì)大鼠血清堿性磷酸酶活性的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清AKP活性升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)Ls高劑量組AKP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠Pmax，Mmax和明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Lmax和骨應(yīng)變具有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)Ls各劑量都能不同程度提高Pmax，Lmax，Mmax和骨應(yīng)變，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 FLs對(duì)大鼠血清堿性磷酸酶活性的影響(±s)

表2 FLs對(duì)大鼠血清堿性磷酸酶活性的影響(±s)

注：與模型組比較#表示P＜0.05。

組別 只數(shù) 劑量/(m g·kg-1)A K P含量(金氏/100 m L)正常組 10 - 22.37±10.35模型對(duì)照組 10 - 23.29±10.80陽(yáng)性對(duì)照組 10 1.5 20.74±5.40 FLs高劑量組 10 200 18.23±9.29#FLs中劑量組 10 100 27.80±16.71 FLs低劑量組 10 50 26.11±14.40

表3 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨力學(xué)指標(biāo)的影響(±s)

表3 FLs對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠骨力學(xué)指標(biāo)的影響(±s)

注：與正常組比較*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。

組別 只數(shù) 劑量(m g/kg) Pm ax(n) Lm ax(m m) M m ax(M) σ(N/m m2) 骨應(yīng)變/%正常組 10 - 103.41±7.28 0.98±0.24 465.6±40.5 99.41±12.65 4.52±1.35模型對(duì)照組 10 - 86.46±6.85**0.85±0.35 380.4±36.4**82.25±11.60*4.04±1.20陽(yáng)性對(duì)照組 10 1.5 97.52±7.64#1.06±0.38#435.2±41.8##101.56±16.54##4.68±0.92#FLs高劑量組 10 200 96.83±6.89#1.23±0.13#455.3±50.2##98.61±12.94##4.66±0.87#FLs中劑量組 10 100 93.56±10.56 0.95±0.34 438.0±52.6#90.50±8.46#4.32±0.66 FLs低劑量組 10 50 91.94±8.34 0.90±0.19 405.6±59.5 86.25±18.40 4.30±1.28

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是威脅老年人健康的一種常見(jiàn)病，以骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變和骨折頻度增加為特征［6-8］。維甲酸是維生素A的衍生物，可影響骨的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝，維甲酸既可增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，又可刺激破骨細(xì)胞使其活性增強(qiáng)，從而使骨代謝呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型改變，但總趨勢(shì)是骨吸收大于骨形成［9-11］。潑尼松為臨床常用藥物，長(zhǎng)期大劑量運(yùn)用可引起內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂及骨質(zhì)疏松等嚴(yán)重不良反應(yīng)［12-14］。本研究結(jié)果顯示，亞麻木酚素(提取物)對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用，為進(jìn)一步研究亞麻木酚素奠定了基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ 朱虎虎，孫煒，孫建新，等.維甲酸誘導(dǎo)雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型建立的效果觀(guān)察［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19(3)：24-26.

［2］ 陳見(jiàn)南.國(guó)外亞麻子保健作用綜合研究和應(yīng)用近況［J］.中國(guó)醫(yī)藥情報(bào)，2001，7(3)：54-56.

［3］ 談志龍，任海龍，白人驍，等.骨質(zhì)疏松癥與骨代謝生化測(cè)定指標(biāo)［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2006，12(1)：89-93.

［4］ 劉錫儀，劉浩宇.大鼠腦源性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2008，14(3)：143-147.

［5］ 徐洪璋，余斌.骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，22(1)：47-50.

［6］ 譚雄進(jìn)，王前，鄭磊，等.不同年齡尾吊鼠負(fù)重骨骨代謝及力學(xué)性能變化［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2003，9(1)：6-8.

［7］ 張鶴，趙雨，李銀清，等.鹿筋膠原對(duì)維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用［J］.中藥材，2010，33(3)：411-413.

［8］ 梁霞，胡曉軍，李群.亞麻木脂素降血糖降血脂與改善骨質(zhì)疏松初步臨床試驗(yàn)研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，12(2)：55-57.

［9］ 吳波，徐冰，黃添友，等.維A酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型與機(jī)理研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31(4)：241-245.

［10］李栓.甘肅鼢鼠骨骼與血液鈣磷代謝分析［J］.陜西師范大學(xué)，2009，29(4)：88-97.

［11］李天清，雷偉，馬真勝，等.狗脊提取物對(duì)去勢(shì)大鼠抗骨質(zhì)疏松活性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2014，20(7)：736-740.

［12］李森，謝人明，孫文基.杜仲籽總苷抗糖皮質(zhì)激素所致小鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2012，32(2)：205-208.

［13］蔡玉霞，張劍宇.補(bǔ)骨脂水煎劑對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(2)：268-271.

［14］于洋，邵秉一，尚馮青，等.雌激素缺乏致骨質(zhì)疏松癥小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)分泌 M CP-1影響T淋巴細(xì)胞趨化及凋亡［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30(1)：19-22.

Effects of Flax Lignans on the Activity of AKP and Bone Biomechanics of the Rats with Experimental Osteoporosis

LI Xingyong1,2,WEI Xiaohui3,LI Xixiang4,LIU Xiaoshuan4,CHEN Erlin4,YANG Haijuan5WU Guotai5
1 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 Gansu Province the Third People′s Hospital;3 The First People′s Hospital of Lanzhou City;
4 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine;5 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To observe the influence of flax lignans (FLs)on bone biomechanics and alkaline phosphatase (AKP)activity of the rats with experimental osteoporosis.Methods:Sixty rats were randomized into normal control group,the model control group,positive control group,high,moderate and low doses groups of FLs, ten rats each group.Except normal control group,other 50 rats accepted intragastric administration of prednisone acetate［20 mg/(kg·d)］for seven consecutive days,and intragastric administration of retinoic acid (80 mg/kg body weight)since the 8th day,once per day,for eight consecutive days.Since the 14 th day,low,moderate and high doses groups of FLs lavaged FLs suspension in the densities of 0.05 g/kg,0.1g/kg,and 0.2 g/kg respectively,and positive control group lavaged estradiol in the concentration of 1.5 mg/kg,normal control group and model control group accepted intragastric administration of distilled water(10 mL/kg),for 14 days consecutively.General states of the rats were observed to detect bone biomechanics and AKP activity.Results:After establishing the models,compared with the normal group,body weight of the rats in the model group decreased significantly (P＜0.05);AKP activity increased;Pmax and Mmax decreasesed obviously(P＜0.05);Lmax and bone strain showed the tendency of lowering.After medicating,compared with the model group,AKP contents of high doses group of FLs lowered(P＜0.05); FLs in different doses could improve Pmax,Lmax,Mmax and bone strain to different extents(P＜0.05).Conclusion: FLs could improve AKP activity,increase Pmax,Lmax,Mmax and bone strain,which suggests that FLs could fight against osteoporosis.

flax lignans;osteoporosis;alkaline phosphatase;bone biomechanics

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0037-03

2015-05-20

李興勇(1963—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，碩士研究生，主任醫(yī)師，甘肅省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)會(huì)副主任委員，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨科微創(chuàng)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)理事，甘肅省醫(yī)院協(xié)會(huì)常務(wù)理事。研究方向：骨關(guān)節(jié)病的診治。