UPLC法同時測定痺苓祛痛顆粒中常春藤皂苷元和齊墩果酸含量

李 瑛 吳小明 汪永忠 段賢春 魏良兵 吳 健 韓燕全

UPLC法同時測定痺苓祛痛顆粒中常春藤皂苷元和齊墩果酸含量

李 瑛 吳小明 汪永忠 段賢春 魏良兵 吳 健 韓燕全

目的 建立UPLC法同時測定痺苓祛痛顆粒中常春藤皂苷元和齊墩果酸含量的方法。方法Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm，1.70 μm)為色譜柱，流動相乙腈-水(90 ∶10)，0.20 mL/min流速，30℃柱溫，205 nm波長為條件。結果常春藤皂苷元和齊墩果酸的進樣量在0.093 2～0.932 0 μg(r=0.9995)、0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)范圍內(nèi)與其峰曲線下面積分別呈良好的線性關系；兩者平均回收率分別為96.28%和98.62%，RSD為2.53%和1.70%。結論建立的含量測定方法簡單、準確、快速，可用于痺苓祛痛顆粒的質(zhì)量控制。

痺苓祛痛顆粒；常春藤皂苷元；齊墩果酸；超高效液相色譜；含量測定

痺苓祛痛顆粒為國家中醫(yī)臨床研究基地(研究病種：糖尿病)特色中藥制劑，處方由威靈仙、當歸、黃柏、萆薢等十味藥組成，具有清熱解毒，祛濕瀉濁，活血通絡之功效。臨床應用多年，對于痛風急性期、間歇期和類風濕性關節(jié)炎紅腫痛患者效果良好[1]。本文采用UPLC法對痺苓祛痛顆粒的有效成分(常春藤皂苷元和齊墩果酸)含量進行測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；KQ3200DB型超聲儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；電子天平(德國賽多利斯 BP211D)。

痺苓祛痛顆粒由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號：20130226、20131012、20140307；常春藤皂苷元(含量測定用，批號：1117333-200904)、齊墩果酸(含量測定用，批號：110709-200505)、對照品購自中國藥品生物制品檢定研究院；液相用試劑為色譜純(美國TEDIA公司)，其它所用試劑均為分析純；蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm,1.70 μm) 色譜柱，柱溫：30℃；以乙腈-水(90 ∶10)為流動相；流速0.20 mL/min， 205 nm檢測。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取常春藤皂苷元和齊墩果酸對照品，置容量瓶中，加入適量CH3OH超聲溶解，冷卻，再用CH3OH補充至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.186 4 mg/mL、0.603 0 mg/mL混合對照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備[1]精密稱定制劑粉末4.0 g濾紙包裹，加乙酸乙酯適量，索式回流提取3 h，棄去提取液，殘渣揮干溶劑，與濾紙筒一起轉(zhuǎn)移至燒瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，取出，放冷后再稱重、補重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣加2.0 mol/L的HCl溶液30 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中水浴加熱回流2 h，取出，冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。少量水洗滌容器，洗滌液合并轉(zhuǎn)移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加CH3OH溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加CH3OH至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

另按痺苓祛痛顆粒處方比例制備不含威靈仙藥材的樣品，同法制備陰性對照溶液。

2 結果

2.1 專屬性考察 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各1.0 μL，進樣測定，結果顯示對照品溶液與供試品溶液在相同的保留時間有對應的色譜峰，而陰性對照溶液在對應的保留時間無色譜峰，表明本法的專屬性良好。見圖1～圖3。

2.2 線性關系考察 吸取配好備用，按梯度逐步稀釋成6個濃度的混合對照品溶液，進樣量1.0 μL逐個進樣，按“2.1”色譜條件測定，記錄AUC。以對照品進樣量為橫坐標，AUC為縱坐標，繪制標準曲線，常春藤皂苷元標準曲線為Y=5 301 271.591 5X+10 863.186 3(r=0.999 5，n=6)，齊墩果酸的標準曲線為Y=22 663 57.336 6X+18 503.3589 (r=0.999 4，n=6)。常春藤皂苷元和齊墩果酸的進樣量分別在0.093 2～ 0.932 0 μg、0.301 5～3.015 0 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液1.0 μL，照上述色譜條件重復6次進樣測定，記錄峰面積。結果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.62%和0.48%(n=6)，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 取20140307批供試品溶液于室溫下放置，分別于0、2、4、8、16、24 h按“1.2.1”色譜條件進樣1.0 μL測定，記錄AUC。結果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.61%和1.08%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性試驗 取20140307批次制劑樣品4.0 g，按1.2.3項下制備方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進樣1.0 μL測定，記錄AUC。結果顯示常春藤皂苷元和齊墩果酸的RSD分別為0.98%和1.48%(n=6)，表明本法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗 取20140307批已知含量的制劑樣品適量6份，精密稱定，分別精密加入適量常春藤皂苷元和齊墩果酸對照品溶液，按“1.2.3”制備方法制備供試品溶液，照“1.2.1”色譜條件進樣測定，記錄AUC，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.7 樣品含量測定 取上述3個批次的制劑樣品各4.0 g，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件各進樣1.0 μL測定，記錄AUC，代入標準曲線計算樣品中常春藤皂苷元和齊墩果酸的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(mg/g)

3 討論

威靈仙古時就為治療痹證的常用方藥，對于痹證的治療效果良好。本文采用UPLC法對痺苓祛痛顆粒君藥威靈仙中的有效成分常春藤皂苷元和齊墩果酸同時進行了含量測定[2,3]，同時測定的方法可以對樣品中的兩個及以上的指標成分進行同步分析，可以減少分析的時間及溶劑的損耗[4]。另外本文采用的UPLC法較普通HPLC法更具有靈敏度高、分離度高、分析時間短和進樣量少等特點[5]，兩者一起大大提高了制劑分析的效率，是對于中藥制劑的復雜成分特別適用，可以在中藥分析中廣泛應用[6]。

由于本實驗供試品溶液提取方法較為復雜，實驗中分別比較了不同濃度的乙醇超聲及水浴回流提取方法，結果發(fā)現(xiàn)與索式提取除雜相比，其他方法中的雜質(zhì)峰干擾均較明顯，雜質(zhì)成分較多，因此本實驗仍采用了2010年版《中國藥典》威靈仙項下的方法處理樣品。

實驗結果表明，本研究建立的同時含量測定方法可行，具有較高分離度和專屬性，可作為痺苓祛痛顆粒的質(zhì)量控制方法之一。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:234.

[2] 郝寧,于艷,張漫霞,等.威靈仙總皂苷和總黃酮超聲提取工藝[J].中藥材,2014,37(5):884-889.

[3] 郭宇姝,竇冕,張沂,等.HPLC-ELSD測定咽炎顆粒中齊墩果酸與常春藤皂苷元[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(2):51-54.

[4] 李璐,林文華,嚴萍,等.不同來源威靈仙常春藤皂苷元和齊墩果酸的含量測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2013,41(7):2910-2911.

[5] 吳健,吳小明,高家榮,等.UPLC同時測定復方守宮散中蒽醌類含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014,16(6):60-62.

[6] 汪永忠,姜蕾,韓燕全,等.超高效液相色譜法同時測定丹蛭降糖膠囊中丹皮酚和芍藥苷含量[J].中國新藥雜志,2012,21(12):1337-1340.

(2014-11-01 收稿 2014-12-22 修回)

Simultaneous determination of ivy sapogenin and oleanolic acid contents in Biling qutong powder by UPLC

LiYing,WuXiaoming,WangYongzhong,etal

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230032,China

Objective To establish a UPLC method for the determination of ivy sapogenin and oleanolic acid in Biling qutong powder. Methods The determination was performed on Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.70 μm) with mobile phase consisted of Acetonitrile-water (90 ∶10)at a flow rate of 0.20 mL/min. Column temperature was 30 ℃.The UV detection wavelength was set at 205 nm. Results The calibration curves were linear in the range of 0.0932～0.9320μg(r=0.999 5) for Ivy sapogenin, 0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)for oleanolic acid. The average recovery was 96.28% and 98.62% respectively, and the RSD was 2.53% and 1.70% respectively. Conclusion The determination method is simple, accurate and fast, which can be used for quality control of Biling qutong powder.

Biling qutong powder; Ivy sapogenin; Oleanolic acid; UPLC; Content determination

安徽中醫(yī)藥大學臨床科學研究基金項目(項目編號：2012LC1-016B)

230032 合肥 安徽中醫(yī)藥大學(李瑛,汪永忠) 230031 合肥 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院(李瑛,吳小明,汪永忠,段賢春,魏良兵,吳健,韓燕全)

汪永忠, wyzhmail@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.003