自噬在骨關節炎軟骨細胞退變中的表達變化

廖法學，馬廣文，常 俊，秦昆鵬，王 清，尹 勇，尹宗生，2

自噬在骨關節炎軟骨細胞退變中的表達變化

廖法學1，馬廣文1，常 俊1，秦昆鵬1，王 清1，尹 勇1，尹宗生1，2

目的探討自噬在骨關節炎（OA）軟骨細胞中的表達及意義。方法收集臨床OA及正常骨關節軟骨標本各6例，分為OA組和對照組。免疫組化法檢測自噬相關蛋白微管相關蛋白輕鏈3（LC3）和Beclin-1在軟骨組織中表達情況。分離關節軟骨細胞并在低氧環境下培養，采用瞬時轉染綠色熒光蛋白LC3（GFP-LC3）在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組軟骨細胞自噬變化，并用Western blot法檢測軟骨細胞中LC3蛋白表達情況。結果OA組軟骨組織中LC3蛋白和Beclin-1蛋白的表達顯著高于對照組（P＜0.05）；在OA組發現大量自噬顆粒形成，OA組GFP-LC3細胞陽性率顯著高于對照組；OA組軟骨細胞中LC3蛋白從LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉換表達顯著高于對照組。結論自噬在OA軟骨細胞退變的過程中起著重要作用，為OA發病機制的研究提供新的方向。關鍵詞 自噬；骨關節炎；軟骨細胞；退變

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨的變性、破壞、骨贅形成及關節間隙變窄為特征的退變性關節疾病，OA致殘率高，是影響人們健康的最嚴重問題之一［1］。自噬通過清除受損或功能失調的大分子、細胞器來維持細胞內穩態，自噬失調引起活性氧增加和基因表達異常，進一步導致細胞死亡［2］。研究［3－4］顯示自噬在正常軟骨中處于保護機制，以避免老化、外傷所引起的細胞死亡，通過誘導小鼠OA模型，檢測ULK1蛋白、Beclin-1蛋白、微管相關蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）的表達減少。增強細胞自噬作用可能作為一種新的途徑來延緩OA軟骨細胞的退變［5］。為進一步研究自噬在OA軟骨退變中的機制，該研究收取臨床OA軟骨標本并分離培養原代軟骨細胞，檢測自噬蛋白表達及自噬形成在兩組中的差異，為OA發病機制提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 病例資料實驗中所有軟骨標本均來自安徽醫科大學第四附屬醫院在2013年接受全膝或全髖關節置換手術的患者，并經過安徽醫科大學第四附屬醫院倫理委員會同意。6例膝OA患者（OA組），其中男2例，女4例；年齡65～76歲（68.7±4.5）歲。6例股骨頸骨折患者（對照組），其中男3例，女3例；年齡65～76歲（67.7±3.6）歲，兩組年齡經過t檢驗比較，差異無統計學意義。OA組患者既往體健，否認風濕、類風濕性關節炎、膝部外傷手術史，符合OA臨床表現、影像學診斷標準。對照組患者既往體健，否認既往關節疾病史，此次股骨頸骨折患者，根據影像學、臨床表現排除OA。

1.2 主要試劑兔源抗LC3蛋白多克隆抗體、兔源抗Beclin-1蛋白多克隆抗體、兔源抗GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot試劑盒購自美國Pierce公司；DAB試劑盒購自武漢博士德公司；DMEM培養基、Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；綠色熒光蛋白輕鏈3（green fluorescent proteinlight chain3，GFP-LC3）購自美國OriGene公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 軟骨組織中LC3、Beclin-1蛋白表達檢測

標本經固定，脫鈣，常規切片后脫蠟，一部分常規HE染色，一部分經過封閉內源性過氧化酶，應用微波爐暴露抗原后封閉內源性生物素，加5%山羊血清阻斷非特異性抗體的結合。分別加兔源抗LC3蛋白多克隆抗體（1∶200，4℃過夜）和兔源抗Beclin-1蛋白多克隆抗體（1∶400，4℃過夜）。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，加DAB溶液顯色10 min，蘇木精復染，脫水，透明，干燥，中性樹脂封片，鏡檢觀察。在40倍光鏡下，每張切片隨機選取10個不重疊的視野，人工計數陽性著色細胞，每個樣本觀察5張不同切片，每組樣本細胞陽性率結果以±s表示，進行統計分析。

1.3.2 原代軟骨細胞分離、鑒定及傳代培養 在無菌條件下取OA組和對照組軟骨組織，在離心管內加入新鮮的0.25%胰蛋白酶，切成碎粒，加入Ⅱ型膠原酶消化，離心棄上清液，收集細胞，加入10% DMEM培養液移入培養皿中，48 h后換液去除未貼壁的細胞，置于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養24 h，顯微鏡下觀察。將原代細胞采用甲苯胺藍染色以便鑒定。待細胞貼壁達80%左右，加0.05%胰蛋白酶消化，收集該細胞懸浮液，離心棄上清液，制成細胞懸浮液，并計數，然后按比例進行傳代培養。

1.3.3 GFP-LC3質粒瞬時轉染及激光共聚焦顯微鏡下檢測自噬細胞 按Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作，分別調OA組和對照組軟骨細胞濃度1 ×105個／m l密度接種于12孔板中，用不含抗生素培養液進行培養過夜，細胞融合度達60%～70%，進行GFP-LC3質粒瞬時轉染；各組軟骨細胞轉染24 h后，將12孔板放入2%O2濃度環境下培養24 h，將12孔板中玻片取出，點一滴防淬滅劑于玻片上，然后將其置于載玻片上，周圍用中性樹膠封片，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。將含有5個及以上綠色熒光顆粒細胞定義為GFP-LC3陽性細胞，采用陽性著色細胞計數法，對結果進行分析統計。

1.3.4 Western blot法檢測LC3蛋白從LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型轉換 提取兩組細胞總蛋白，應用Bradford法測蛋白濃度，調整兩組蛋白濃度相同，將兩組蛋白進行SDS-PAGE電泳后將蛋白從凝膠轉移到NC（硝酸纖維素）膜上，進行Western blot法檢測，即經5%脫脂奶粉（PBS配置）4℃封閉過夜，依次加入兔源抗LC3蛋白多克隆抗體（1∶2 000，4℃過夜）及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫作用1 h，充分洗滌后ECL發光，觀察結果。采用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，并將待檢測蛋白條帶的灰度值與同一樣品內參蛋白（GAPDH作為內參蛋白）的灰度值進行比較。

1.4 統計學處理使用SPSS 16.0統計軟件進行分析，數據均以±s表示，運用t檢驗進行比較。

2 結果

2.1 自噬相關蛋白LC3、Beclin-1在軟骨組織中表達采用免疫組化法檢測軟骨上層區域（包括軟骨淺表和中層）中的自噬相關蛋白LC3、Beclin-1在兩組標本中表達情況。首先對軟骨標本常規HE染色，OA組關節軟骨表面粗糙，軟骨細胞核固縮、裂解、壞死，偏于一側，軟骨細胞排列紊亂，符合OA表現；對照組關節軟骨表面光滑，軟骨細胞排列整齊，細胞核清晰，染色均勻，軟骨基質分布勻稱。兩組標本免疫組化結果見圖1，采用陽性著色細胞計數法，結果分析見圖2，在OA組中LC3、Beclin-1蛋白表達細胞陽性率為（50.3±4.2）%和（64.4±6.6）%，相比于對照組（24.3±3.6）%和（31.8±6.9）%表達增高，差異均有統計學意義（t＝11.51、8.36，P＜0.05）。

2.2 軟骨細胞鑒定為了鑒定體外分離的原代軟骨細胞，通過甲苯胺藍染色法來鑒定細胞，形態學觀察結果顯示：原代培養的軟骨細胞甲苯胺藍染色以淺藍色為主，根據軟骨細胞分泌的蛋白多糖的染色鑒定為軟骨細胞。實驗中所用兩組細胞均為軟骨細胞，見圖3。

2.3 低氧對體外培養軟骨細胞自噬變化影響采用體外低氧環境下培養軟骨細胞，為了觀察細胞自噬變化，將帶有GFP-LC3的質粒轉入軟骨細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發現：在OA組發現大量自噬顆粒形成，見圖4A，OA組GFP-LC3細胞陽性率為（45.3±8.4）%，而對照組軟骨細胞陽性率為（20.1±5.9）%，差異有統計學意義（t＝6.01，P＜0.05）。隨后Western blot法檢測結果顯示：OA組軟骨細胞LC3蛋白從LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉換增加，提示自噬水平升高。見圖5。

3 討論

LC3蛋白屬于自噬相關蛋白家族中的一員，參與自噬過程中的不同階段［6］，Beclin-1蛋白控制自噬過程，其過度表達可持續增加自噬泡數量［7］，檢測LC3和Beclin-1蛋白的表達可以判斷細胞自噬的活性。本研究結果表明OA組軟骨組織中自噬相關蛋白高表達，這一結果與Caramés et al［3］和Wu et al［8］研究結果不一致，研究顯示在OA組軟骨組織中自噬相關蛋白LC3和Beclin-1的表達顯著下降。考慮有兩種原因：①OA組可能是嚴重的OA，由于關節軟骨嚴重磨損所致軟骨細胞的減少；②對照組年齡比較小，平均年齡分別為22.4歲和55歲。而本研究與Sasakiet al［9］的研究結果是一致的，在動物模型中的結果也證實了本研究的結果［10－11］，通過免疫組化法和Western blot法檢測顯示在鼠OA模型軟骨細胞中LC3-Ⅱ蛋白顯著高于正常鼠軟骨細胞。本研究為了模擬體內關節軟骨的低氧環境，在2%O2濃度環境下培養軟骨細胞，在OA軟骨細胞中自噬活性增強，這一結果與Caramés et al［3］是一致的。

本研究結果提示自噬可能在OA中起破壞性作用。目前對于OA晚期細胞死亡形態變化，一直存在爭議。Aigner et al［12］認為在OA軟骨細胞中凋亡并不是十分普遍的現象，研究顯示OA軟骨細胞隨年齡增長而減少不到5%。Roach etal［13］認為軟骨細胞的衰老與傳統的細胞凋亡有區別，對OA中軟骨細胞發生凋亡產生了質疑，軟骨細胞是以一種Chondroptosis形態，是有別于細胞凋亡的另一種死亡類型。自噬也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，這種形式的細胞死亡區別于細胞凋亡，其表現為細胞質中涌現大量包裹著細胞器的空泡樣結構，以及溶酶體對空泡內成分的降解［14］。

由此看來，自噬對OA軟骨細胞可能會導致細胞程序性死亡。OA是退變性關節疾病，可以通過調控軟骨細胞自噬水平，以延緩軟骨老化及OA病程發展。

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Autophagy expression in chondrocytes from a degenerate of osteoarthritis

Liao Faxue，Ma Guangwen，Chang Jun，et al
（Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To explore the autophagy expression and examine its significance in chondrocytes from a degenerate of osteoarthritis（OA）.MethodsCartilage samples were obtained from 12 hospitalized patients in our hospital.They were divided into the OA group（n＝6）and the control group（n＝6）.Expressions of light chain3（LC3）and Beclin-1 protein which weremain markers of autophagy were analyzed in cartilage tissues by using immunohistochemistry（IHC）.Cartilage chondrocytes were isolated and cultured in a hypoxia environment in vivo. The chondrocytes which were transfected with green fluorescent protein-light chain3（GFP-LC3）plasmid were examined under a laser scanning confocalmicroscopy.Western blotwas used to observe the LC3 protein expression in chondrocytes.ResultsIn cartilage tissues LC3 and Beclin-1 protein expressions were markedly increased in OA chondrocytes.A large number of autophagy particle formationswere found in the OA group，the percentage of chondrocytes with GFP-LC3 puncta structureswas higher in the OA group than the control group.The results revealed a significant increase in the expression of LC3-IIprotein in the OA group.ConclusionAutophagy plays an important pathogenic role in the process of OA chondrocytes degeneration.It offersa new research direction for the pathogenesis of OA.

autophagy；osteoarthritis；chondrocytes；degenerate

R 684.3；R 361＋.3

A

1000－1492（2015）08－1077－04

2015－04－22接收

高等學校博士學科點專項科研基金聯合資助課題（編號：20123420110002）；安徽醫科大學校科學研究基金（編號：2013xkj046）

安徽醫科大學1第四附屬醫院骨科、2第一附屬醫院關節

與骨腫瘤外科，合肥 230032

廖法學，男，碩士，醫師；

尹宗生，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：yinzongsheng＠sina.com