膀胱腫瘤中受體酪氨酸激酶基因的表達及臨床意義

羅志剛 鄧剛

[摘要] 目的 研究受體酪氨酸激酶基因（RON和EphA2）在膀胱腫瘤中的表達及臨床意義。 方法 選取我院收集的膀胱腫瘤新鮮組織標本112例，其中TCCB82例、IPB14例、PUNLMP16例，選取同期正常膀胱黏膜20例為對照組，測定各組標本RON及EphA2相對基因表達水平并分析。 結果 RON和EphA2在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量均明顯高于對照組（P<0.05），隨TCCB病理分級的升高（即分化程度降低）、臨床分期升高，RON mRNA和EphA2 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）；RON mRNA和EphA2 mRNA表達水平與TCCB病理分級及臨床分期呈正相關性。 結論 RON及EphA2可高表達于膀胱腫瘤組織中，可能與TCCB的發生發展具有一定關系。

[關鍵詞] 受體酪氨酸激酶基因；膀胱腫瘤；基因表達

[中圖分類號] R737.14 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）17-0004-04

膀胱腫瘤是臨床上泌尿系統的常見病、多發病之一，在我國位居泌尿系腫瘤首位，約占惡性腫瘤的4%，近年來其發病率呈逐年升高趨勢[1]。研究表明，約95%膀胱腫瘤組織來源為膀胱上皮，其中絕大部分為惡性，其中又以膀胱上皮移行細胞癌最為多見[2-4]。隨著分子醫學技術的不斷發展與進步，研究發現膀胱癌的發生發展可能與一系列特定基因改變有關，如受體酪氨酸激酶基因。RON是一種酪氨酸激酶受體，屬MET原癌基因，可使細胞失去精密鏈接及極性，誘導上皮細胞轉移、浸潤，促進細胞分散、播散、遷移及浸潤[5]。RON作為癌蛋白中的一種，在人體上皮性腫瘤的發生發展中起到了不可忽視的作用[6]。EphA2亦是一種酪氨酸激酶受體，可參與并調控人體細胞的生長、發育、生存、遷移等生物學行為，如過度表達可促進腫瘤細胞的生長及惡變[4，7]。本文旨在研究RON、EphA2在膀胱腫瘤組織中的表達情況并分析比較，初步探討其可能的致癌機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選擇2011年1月～2014年1月間我院收集的膀胱腫瘤新鮮組織標本112例，其中膀胱移行細胞癌（TCCB）82例、內翻性乳頭狀瘤（IPB）14例、低度惡性潛能尿路上皮瘤（PUNLMP）16例，其中男59例、女53例，年齡32～78（56.38±4.08）歲，TCCB臨床分期：Ta～T1 25例、T2～T3 36例，T4 21例，病理分級：Ⅰ級35例、Ⅱ級21例、Ⅲ級26例，以上診斷標準均符合WHO（世界衛生組織）TCCB病理分級及UICC（國際抗癌聯盟）臨床分期標準[8]。選取同期因外傷導致膀胱破裂者并經病理證實健康的正常膀胱黏膜20例為對照組，男12例、女8例，年齡18～68（35.47±3.19）歲。以上病例均為首次發現并診斷，未行放化療，且診斷均經病理組織學證實。

1.2 FA-RT-PCR方法

1.2.1 儀器與試劑 美國ABI公司系列產品：ABI7000 PCR儀、DU800紫外分光光度計；上海仕博公司H6-1微型電泳儀；Trizol RNA抽提試劑盒、MBI Fermentas公司逆轉錄cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.2.2 方法 按RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒實驗流程提取組織樣本RON mRNA和EphA2 mRNA并合成樣本相應cDNA。

1.2.3 RON 引物由上海基康生物技術有限公司合成：5-GCTACATCAACTCCCACATCACC-3，下游引物為5-GGGGTCTCGGACCACATATTC-3，內參照GAPDH上游引物為5-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3，下游引物為5-CTGGAAGATGGTGATG-GGATT-3。反應體系如下：cDNA 2 μL、0.6 μmol/L上游引物0.2 μL、0.6 μmol/L下游引物0.2 μL、SYBR Green Ⅰ 10 μL、DEPC水7.6 μL，總反應體積為20 μL。擴增條件如下：95℃預變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火0.5 min，40循環。每次試驗均設置1個陽性、陰性、空白對照。

1.2.4 EphA2 引物由上海生工合成：上游引物為5-CACTTACCGCAAGAAGGGAG-3，下游引物為5-CACCAGAAGCAGGACCACA-3，內參照β-actin上游引物為5-GGGACCTGACTGACTACCTCA-3，下游引物為5-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3。反應體系如下：cDNA 3 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、SYBR Green Ⅰ 10 μL、DEPC水5 μL，總反應體積為20 μL。擴增條件如下：94℃ 5 min、94℃ 15 s、54℃ 15 s，39次循環。每次試驗均設置1個陽性、陰性、空白對照。

1.3 RON及EphA2 mRNA表達相對定量分析

實驗確定2-ΔCT方法適用性后，以對照組樣本為參照因子，行內標均一化處理，然后通過公式ΔCTRON=CtRON-CtGAPDH、ΔCTEphA2=CtEphA2-Ctβ-actin計算出各樣本組織中RON及EphA2 mRNA相對表達定量。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析，偏態分布數據用中位數表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RON及EphA2 mRNA在膀胱腫瘤組織中的表達

在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可檢測到RON mRNA及EphA2 mRNA的表達。RON mRNA在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量雖略有差異，但在統計學上無意義（P>0.05）；EphA2 mRNA在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量雖略有差異，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 RON及EphA2 mRNA在TCCB組織中的表達

隨TCCB病理分級升高（即分化程度降低），RON mRNA表達水平升高，不同分級組織RON mRNA相對表達定量差異明顯，有統計學意義（P<0.05）；隨TCCB臨床分期升高，RON mRNA表達水平升高，不同臨床分期組織RON mRNA相對表達定量差異明顯，有統計學意義（P<0.05）；隨TCCB病理分級升高（即分化程度降低），EphA2 mRNA表達水平升高，不同分級組織EphA2 mRNA相對表達定量差異明顯，有統計學意義（P<0.05）；隨TCCB臨床分期升高，EphA2 mRNA表達水平升高，不同臨床分期組織EphA2 mRNA相對表達定量差異明顯，有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 RON及EphA2 mRNA與TCCB病理分級及臨床分期相關性

Spearman等級相關分析表明RON mRNA表達水平與TCCB病理分級及臨床分期呈正相關，EphA2 mRNA表達水平亦與TCCB病理分級及臨床分期呈正相關，見表3。

表3 RON及EphA2 mRNA與TCCB病理分級及臨床分期相關性分析

3 討論

膀胱腫瘤是泌尿系常見病之一，發病率高、惡心率高、死亡率高。近年來，膀胱腫瘤發病率逐年升高，位居我國男性泌尿系統腫瘤首位[8-10]。約95%膀胱腫瘤來源于膀胱上皮，其余部分來源于間葉組織，其中絕大部分腫瘤性質為惡性，以TCCB為主，只有少數部分性質為良性，IPB即為一種少見良性腫瘤，發病率約占膀胱腫瘤的6%，部分IPB可伴發或轉化為TCCB。PUNLMP是一種介于良惡性腫瘤間的尿路上皮腫瘤，具有低度惡性潛能[8]。膀胱惡性腫瘤是一種病因、發病機制復雜的多階段、多步驟疾病，臨床治療效果較差，其發病機制的研究則成為膀胱腫瘤治療的關鍵。

RON為MET原癌基因之一，屬酪氨酸激酶受體，亦是一種癌蛋白，其在人體上皮性腫瘤中研究較多，發現RON在皮膚、大腸、乳腺、胃、卵巢腫瘤中表達水平高，顯示RON與上皮性腫瘤發生發展可能存在一定的關系[11，12]。然而，目前RON在膀胱腫瘤中研究較少。在本研究中，RON mRNA在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可表達，而在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量均明顯高于正常對照組（P<0.05），說明RON可能在腫瘤早期發揮一定作用。而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量雖略有差異，但無統計學意義（P>0.05），我們推測RON可能并未表達在IPB細胞膜上，進而未激活致癌作用。此外，本研究中RON mRNA表達水平隨TCCB病理分級和臨床分期升高而升高，其與TCCB病理分級及臨床分期呈正相關，說明RON表達水平可能與TCCB浸潤能力及分化程度存在一定聯系，與Cheng等[13]研究結論相符。

EphA2亦是一種受體酪氨酸激酶，可參與細胞生長調節、血管形成、神經傳導、細胞遷移、細胞生存等生物學行為，可低水平表達于人體正常上皮細胞中[14]。在前列腺癌、乳腺癌等研究中發現EphA2處于高表達狀態且可促進腫瘤惡性發展[15]。EphA2在膀胱腫瘤中的研究亦較少。本研究中，EphA2 mRNA在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可表達，而在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對表達量均明顯高于正常對照組（P<0.05），說明EphA2可能在腫瘤早期發揮一定作用。EphA2 mRNA在IPB中高表達水平與TCCB、PUNLMP中表達水平差異不明顯（P>0.05），EphA2 mRNA表達水平隨TCCB病理分級和臨床分期升高而升高，其與TCCB病理分級及臨床分期呈正相關，說明EphA2表達水平可能與TCCB浸潤能力及分化程度存在一定聯系，其高表達可能會促進IPB惡性發展，結果與Pratt等[15]研究結論相符。

綜上所述，RON及EphA2可高表達于膀胱腫瘤組織中，在TCCB中其表達水平與病理分級及臨床分期呈正相關性，兩者可能與TCCB的發生發展具有一定關系，亦可能促進腫瘤性發展。今后應繼續加強RON及EphA2傳導及調控網絡的研究，為膀胱腫瘤發生發展研究更多有意義的靶點，為膀胱腫瘤的防治措施提供新的突破可能。

[參考文獻]

[1] 張思維，馬建輝，李鳴，等. 中國部分市縣膀胱癌發病趨勢比較研究[J]. 中華泌尿外科雜志，2009，30（10）：673-676.

[2] Liu HS，Hsu PY，Lai MD，et al. An unusual function of RON receptor tyrosine kinase as a transcriptional regulator in cooperation with EGFR in human cancer cells[J].Carcinogenesis，2010，31（8）：1456-1464.

[3] Camp ER，Liu W，Fan F，et al. Ron，a tyrosine kinase receptor involved in tumor progression and metastasis[J]. Ann Surg Oncol，2005，12（4）：273-281.

[4] 馮瑞，李中興，沈斌，等. SYK和CA125在綠激光治療非肌層浸潤性膀胱腫瘤中的臨床意義[J]. 寧夏醫科大學學報，2014，36（7）：786-789.

[5] Bardella C，Costa B，Maggiora P，et al. Truncated RON tyrosine kinase drives tumor coll progression and abrogates cell adhesion through eeadherin transcriptional repression[J].Cancer Res，2004，64（15）：5154-5161.

[6] 郭飛，陳玉華，劉永霞，等. 受體酪氨酸激酶基因及其變異體在膀胱腫瘤組織中的表達及意義[J]. 中華檢驗醫學雜志，2011，34（9）：1026-1027.

[7] 郭飛. 受體酪氨酸激酶基因及其變異體在膀胱腫瘤組織中的表達及意義[D]. 溫州醫學院，2011.

[8] 張正潮. 成纖維細胞生長因子受體3與膀胱腫瘤治療的研究進展[J]. 國際泌尿系統雜志，2014，34（3）：406-409.

[9] 李春生. Mta-1與Ezrin在膀胱移行細胞癌組織中的表達及相關性[J]. 中國現代醫生，2011，48（28）：4-5.

[10] 張平，董自強，毛崢，等. 膀胱腫瘤中EphA2 mRNA的表達及其生物學行為關系研究[J]. 現代泌尿生殖腫瘤雜志，2010，2（1）：38-41.

[11] 王金清，趙玉斌，張少華，等. EphA2、EphrinA 1在膀胱癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中國醫師進修雜志，2010，33（35）：56-57.

[12] 李清，楊金瑞，李解方，等. EphA 2在膀胱移行細胞癌中的表達及其意義[J]. 醫學臨床研究，2014，31（1）：1321-1322.

[13] Cheng HL，Lin HS，Lin YJ，et al. Co-expression of RON and MET is a prognostic indicator for patients with transitional-cell carcinoma of the bladder[J]. Br J Cancer，2005， 92（10）：1906-1914.

[14] 杜義恒. 腦源性神經營養因子及酪氨酸激酶受體B可能成為治療膀胱腫瘤的新靶點[J]. 現代泌尿外科雜志，2014，19（8）：555-558.

[15] Pratt RL，Kinch MS. Ligand binding up-regulates EphA2 messenger RNA through the mitogen-activated protein/ex-tracellular signal-regulated kinase pathway[J]. Mol Cancer Res，2003，l（14）：1070-1076.

（收稿日期：2015-01-26）