青蛤Cyclina sinensis）IRAK—4基因的克隆及其組織間的表達(dá)分析

楊瑩 高珊 潘寶平 鄭津輝 高虹

摘要 利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得了青蛤（Cyclina sinensis）白介素-1受體相關(guān)激酶-4（Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）基因的序列信息，利用巢式及熒光定量PCR克隆并分析了CsIRAK-4基因在青蛤各組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步在鰻弧菌的脅迫下檢測了CsIRAK-4基因在青蛤血淋巴中的時序表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因的序列全長共2 687 bp，其開放閱讀框長1 926 bp，共編碼641個氨基酸，CsIRAK-4基因在青蛤的血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓中均表達(dá)，其中在血淋巴中表達(dá)量最高，肝臟中表達(dá)量最低。青蛤在鰻弧菌脅迫下該基因的表達(dá)量在3 h即達(dá)到最大值，與對照組差異極顯著（P<0.01），證明該基因所表達(dá)的產(chǎn)物是青蛤重要的免疫信號通路蛋白。

關(guān)鍵詞 青蛤；轉(zhuǎn)錄組文庫；熒光定量PCR；CsIRAK-4

中圖分類號 S917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-033-04

青蛤（Cyclina sinensis）是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，棲息于富于泥沙、泥漿的沿海潮汐地帶，廣泛分布于東海、黃海、南海等地[1]。青蛤的營養(yǎng)價(jià)值豐富，肉質(zhì)鮮美，且其生長周期短，耐鹽性好，存活率高，在離水后可較長時間生存[2-3]，對于不良生存環(huán)境有較好的抵御能力[4-5]。近年來，青蛤增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致青蛤的病害連年發(fā)生，使該項(xiàng)產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重威脅[6-8]。因此對于青蛤免疫抗病害研究具有重要的實(shí)踐意義。

貝類屬于非特異性免疫系統(tǒng)，其中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是非特異性免疫反應(yīng)中一類重要的識別受體，在對抗病原物的侵染過程中起著關(guān)鍵作用[9-14]。白介素-1受體相關(guān)激酶（Interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAKs）是TLRs信號通路中的重要成員之一[9，15]。其中白介素-1受體相關(guān)激酶-4（Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）是IRAKs家族中最后發(fā)現(xiàn)的一個成員[16-17]。IRAK-4基因與IRAKs家族中其他基因結(jié)構(gòu)相似，但缺少一個C端結(jié)構(gòu)域，且行使功能時需要利用其自身激酶的活性[18-19]。研究表明，IRAK-4基因與細(xì)胞免疫過程中T細(xì)胞受體的識別過程密切相關(guān)[20]，這表明，先天免疫系統(tǒng)與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間有著錯綜復(fù)雜的聯(lián)系，而IRAK-4基因在兩者之間起著媒介作用。由此可見，IRAK-4基因在機(jī)體的免疫過程中至關(guān)重要。

目前，IRAK-4基因在脊椎動物中的相關(guān)研究較多，而在無脊椎動物中研究極少，僅在長牡蠣（Crassostrea gigas）和雜色鮑（Haliotis diversicolor）中有相關(guān)報(bào)道。在與青蛤同源性最高的雜色鮑中，IRAK-4基因在各個組織中均表達(dá)[9]。目前并未發(fā)現(xiàn)IRAK-4基因在青蛤中的相關(guān)研究，該研究在提高青蛤免疫能力及探索其抗病害機(jī)理方面具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤樣品采集于天津大港灘涂，暫養(yǎng)于人工通氣海水中，海水密度1.02～1.04 g/cm3，水溫21～24 ℃，pH 7.0，投喂5‰小球藻。飼養(yǎng)7 d后，選取表面無破損，形態(tài)上無顯著差異的個體[平均殼寬（19.12±0.57）mm，平均殼長（29.14±1.23）mm，平均殼高（29.52±1.47）mm）]進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理。

將鰻弧菌（Vibrio anguillarum）菌種在2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，后用無菌海水離心洗脫3次，重懸菌液，將濃度調(diào)為OD600=0.4。隨機(jī)分組，每次試驗(yàn)設(shè)置10個平行組。將鰻弧菌菌液注入至試驗(yàn)組青蛤體內(nèi)，50 μl/只，對照組注射等量的滅菌海水。在注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、鰓、閉殼肌和性腺，分別在注射后3、6、12、24、48、96 h提取血淋巴。準(zhǔn)確稱取各組織50 mg，后放入液氮中冷凍備用。

1.2.2 青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建。

利用TRIZOL提取青蛤各個組織的總RNA，用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒分離mRNA。采用第二代MiSeq測序儀，pair end 雙端模式完成青蛤轉(zhuǎn)錄組測序，利用De novo RNA-seq analysis技術(shù)，綜合分析相關(guān)基因功能注釋和代謝途徑，后通過篩選得到CsIRAK-4基因的類似序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析。

利用獲得的CsIRAK-4基因類似序列設(shè)計(jì)克隆引物CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′，并進(jìn)行克隆，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對，利用開放閱讀框（open reading frame，ORF）在線分析軟件分析其開放閱讀框，使用Sig-nalP 3.0分析該基因的信號肽序列，利用SMART查找其結(jié)構(gòu)域，ProtParam工具在線預(yù)測此序列的分子量、分子式和等電點(diǎn)，使用Clustal W對氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多重比對。

1.2.4 IRAK-4基因在青蛤各組織內(nèi)的表達(dá)。

利用TRIZOL法提取青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，實(shí)時定量引物分別為βactin-S：5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′，βactin-A：5′-C-CGATAGTGATGACCTGACC-3′；CsIRAK-4-S：5′-AGATGGAGGCAGGGTGAT-3′，CsIRAK-4-A：5′-TGGCAGAGGTGGCGTATT-3′；反應(yīng)在 Rotor-Gene 6000實(shí)時定量 PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增體系為 20 μl，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達(dá)。

利用TRIZOL法提取鰻弧菌侵染后各時間點(diǎn)血淋巴的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。熒光定量PCR引物、反應(yīng)體系及程序等參照“1.2.4”。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蛤IRAK-4基因的結(jié)構(gòu)

CsIRAK-4基因開放閱讀框長1 926 bp，共編碼641個氨基酸（圖1）；其共有2個結(jié)構(gòu)域：DEATH結(jié)構(gòu)域（35～129）和S_Tkc結(jié)構(gòu)域（380～638）；其理論分子量為72 552.8，等電點(diǎn)為5.89，分子式為C3206H5069N879O1005S17，氨基酸組成中亮氨酸（Leu）最高，占9.2%。此基因在GenBank的注冊號為KR732936。

2.2 青蛤IRAK-4基因的分子系統(tǒng)學(xué)分析

將CsIRAK-4基因與NCBI上已有的其他物種的IRAK-4基因進(jìn)行同源性比對，使用MEGA4.1軟件構(gòu)建CsIRAK-4基因的系統(tǒng)樹（圖2），利用bootstrap1000個循環(huán)檢驗(yàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的置信度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜色鮑（Haliotis diversicolor）、紅鮑螺（Haliotis rufescens）、霸王蓮花青螺（Lottia gigantea）、夏威夷短尾魷魚（Euprymna scolopes）與CsIRAK-4基因在同一分支，此基因與紅鮑螺（Haliotis rufescens）IRAK-4基因的同源性最高，達(dá)57%。

2.3 青蛤IRAK-4基因在不同組織間的表達(dá)

以β-actin基因在各組織中的表達(dá)量為內(nèi)參對照，利用實(shí)時熒光定量PCR分析CsIRAK-4基因在其血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、性腺和鰓6個組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CsIRAK-4基因在此6個組織中普遍表達(dá)（圖3），但表達(dá)量明顯不同，在血淋巴中表達(dá)量最高，與其他組織相比差異極顯著（P<0.01），閉殼肌次之，肝臟中表達(dá)量最低。表明CsIRAK-4基因主要在血淋巴中表達(dá)。

2.4 在鰻弧菌刺激下青蛤IRAK-4基因在血淋巴中的時序性表達(dá)

以鰻弧菌侵染青蛤β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用實(shí)時熒光定量PCR儀對CsIRAK-4基因在血淋巴中表達(dá)的時序性變化進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組在刺激后3 h的表達(dá)量達(dá)到最大值，明顯高于對照組，約為對照組的17倍，并與對照組存在極顯著差異（P<0.01）；3 h后表達(dá)量開始下降。

3 討論

該研究通過構(gòu)建青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的方法獲得了CsIRAK-4基因的類似序列，利用此序列設(shè)計(jì)引物并克隆，后進(jìn)行測序，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因在進(jìn)化中比較保守，與許多水生動物的IRAK-4基因具有明顯的相似性。通過SMART分析其蛋白序列，發(fā)現(xiàn)CsIRAK-4基因共有2個結(jié)構(gòu)域，分別為死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain）和激酶結(jié)構(gòu)域（S_TKc Domain），死亡結(jié)構(gòu)域位于第35～129個氨基酸之間，激酶結(jié)構(gòu)域位于第380～638個氨基酸之間。死亡結(jié)構(gòu)域作為一種中介將死亡受體和胞漿信號相連通，在控制機(jī)體的凋亡過程中有重要作用。在IRAK基因家族中，只有IRAK-1基因、IRAK-4基因具有包含激酶結(jié)構(gòu)域的功能催化位點(diǎn)[21]，但只有IRAK-4基因在下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中使用其激酶活性。同時，IRAK-4基因還具有一個高度保守的賴氨酸殘基，此殘基位于ATP結(jié)合位點(diǎn)，在ATP的水解過程中起關(guān)鍵作用[17，22]。IRAKs在TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的媒介作用[20，23]，因此在先天免疫過程中IRAKs極為關(guān)鍵。

該研究結(jié)果顯示，CsIRAK-4基因在各個組織普遍表達(dá)，在血淋巴中表達(dá)量最高，閉殼肌次之，后依次為鰓、外套膜、性腺，在肝臟中表達(dá)量最低。貝類所具有的非特異性免疫體系中，血液的吞噬作用往往是抗病害的第一道防線，青蛤血液中含有大量的吞噬細(xì)胞、抗菌性物質(zhì)及酶原物質(zhì)，在病原物侵染過程中其免疫作用非常關(guān)鍵。血細(xì)胞中的CsIRAK-4基因上調(diào)最為明顯，說明血淋巴作為軟體動物的非特異性免疫防御的首要組織擔(dān)當(dāng)著機(jī)體非特異性免疫防御的重任。而鰓和外套膜在軟體動物生存過程中最先接觸外界環(huán)境，是軟體動物抵御外界傷害的第一道防線，因此在其非特異性免疫過程中也極其重要。

CsIRAK-4所表達(dá)的產(chǎn)物是TLRs信號通路中重要的信號蛋白之一，當(dāng)青蛤受到鰻弧菌脅迫后，其血淋巴中該基因在3 h即表達(dá)至最大值，說明病原物對TLRs免疫受體及下游 CsIRAK-4信號通路蛋白具有強(qiáng)烈的識別與誘導(dǎo)作用，可使其血液中快速合成相應(yīng)的免疫信號蛋白，對抗外來脅迫物對機(jī)體自身的侵害。并且CsIRAK-4基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，證明CsIRAK-4基因參與了非特異免疫的全部過程。該試驗(yàn)結(jié)果為今后貝類增養(yǎng)殖中的病害防治提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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