具有漆酶活性細菌的鑒定及芽孢漆酶對染料脫色的研究

蘇詩茜　孫海瓊　劉少楠　蘇秋鈺　崔岱宗

摘要 [目的]為了研究具有漆酶活性的新菌株的生長特性及其芽孢漆酶對各種染料的脫色效果。[方法]利用經典的形態學、生理生化反應特性和現代分子生物學的方法，對具有漆酶活性的菌株進行鑒定，研究溫度、pH、NaCl和Cu2+對菌株生長的影響，并且研究菌株的芽孢漆酶對常用染料的脫色效果。[結果]該菌株為芽孢桿菌屬的細菌，被命名為Bacillus sp.10`ZS。菌株10`ZS的最適生長pH為60，最適生長溫度為35 ℃，能耐受濃度6% NaCl和0.6 mmol/L Cu2+。菌株10`ZS的芽孢漆酶對結晶紫和活性亮藍的脫色率分別為879%和78.5%。[結論]菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的特性，能在堿性條件下生長，其芽孢漆酶對三苯甲烷類和蒽醌類染料的脫色率較高。

關鍵詞 芽孢桿菌屬；芽孢漆酶；染料脫色

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-014-03

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種多銅氧化酶，能夠將氧氣還原為水，同時介導芳環化合物的氧化。漆酶對底物的特異性低，能氧化多種污染物，在廢水處理和生物修復方面具有很大的潛力[1]。工業生產的條件比較苛刻。在高溫、極酸或極堿的環境下[2]，要求有極高穩定性的漆酶。與細菌漆酶相比，雖然真菌漆酶氧化還原能力較強，產量較高[3]，但是其穩定性比較低，pH范圍比較窄，而且活性易受鹽溶液的影響[4]。近年來，細菌漆酶以其固有的熱和堿性pH穩定性作為具有潛力的生物催化劑而被廣泛研究[5]。

染料被應用于紡織、皮革、醫藥、化妝品和塑料工業。大多數染料由于其復雜的化學結構而具有毒性，并且不易被降解。工業上的染料廢水對人類的健康有很大的危害[6]。采用生物酶法處理染料廢水比采用物理、化學方法處理具有節約成本的優勢[7]。漆酶能使多種合成染料脫色[8]，對環境污染的治理具有潛在的意義。筆者從東北林業大學實驗林場的土壤中分離出一株具有漆酶活性的新菌株。它對三苯甲烷類和蒽醌類染料具有較高的脫色率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株10`ZS由從東北林業大學實驗林場樟子松林下的土壤中分離。

1.2 方法

1.2.1 菌株10`ZS的形態學及生理生化反應特性。

菌株10`ZS的革蘭氏染色和糖類分解、明膠液化及硝酸鹽還原等生理生化特性測定方法見參考文獻[9]。

1.2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統發育樹的構建。

細菌的16S rDNA通用引物27F：5` GAGTTTGATCMTGGCTCAG3` （M=A+C）和1492R：5` TACGGYTACCTTGTTACGACTT3` （Y=C+T）[10]，由華大基因公司合成。以CTAB法提取的菌株10`ZS的總DNA為模板進行PCR反應，20 μl反應體系組成為：10×Taq反應緩沖液2 μl，10 mmol/L的dNTP 0.4 μl，5 μmol/L的上、下游引物各4 μl，3 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環30次，72 ℃延伸10 min。

擴增產物經濃度1.0%瓊脂糖凝膠分離后，對擴增片段進行回收，將回收的目的片段與pMD18T Simple載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性轉化子，進行菌落PCR鑒定，將陽性轉化子送華大基因公司對菌株10`ZS的16S rDNA進行測序分析。

將測序結果在NCBI上進行BLAST分析，選取同源性較高的序列，利用Clustal X軟件進行多序列比對，用Phylip軟件的最大簡約法構建系統發育樹。

1.2.3 菌株生長特性的研究。

將菌株10`ZS分別在25、30、35和40 ℃條件下培養12 h，測定菌液的OD600，研究溫度對菌株生長的影響。將菌株10`ZS在pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0的條件下培養12 h，測定菌液的OD600，研究pH對菌株生長的影響。將菌株10`ZS分別接種到質量分數為1%、2%、4%和6%NaCl的LB培養基中，培養12 h，測定菌液的OD600，研究NaCl溶液對菌株生長的影響。將菌株10`ZS分別接種到Cu2+濃度為0、0.2、0.4和0.6 mmol/L的LB培養基中，培養12 h，測定菌液的OD600，研究Cu2+對菌株生長的影響。重復3次。

1.2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對染料脫色的研究。

芽孢漆酶懸液的制備、漆酶活性的測定方法及芽孢漆酶對染料的脫色方法見參考文獻[11]。活性亮藍（RBBR）、活性黑、靛紅和結晶紫分別屬于蒽醌、偶氮、靛藍和三苯甲烷類染料。

2 結果與分析

2.1 菌株10`ZS的形態學及生理生化反應特性

菌株10`ZS革蘭氏染色呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀，具有芽孢。菌株10`ZS能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇，具有明膠酶（表1）。

2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統發育樹的構建

由圖1可知，菌株10`ZS的16S rDNA擴增條帶清晰，沒有非特異性擴增片斷，大小在1.5 kb左右，其測序結果為1 451 bp。將菌株10`ZS的16S rDNA序列在NCBI網站進行BLAST同源性分析，它與芽孢桿菌屬同源性達99%。結合該菌株的形態和生理生化特性，將其命名為Bacillus sp.10`ZS。利用Clustal X軟件對菌株10`ZS、其他菌株的的16S rDNA進行多序列比對，用Phylip軟件的最大簡約法構建系統發育樹（圖2）。

2.3 菌株10`ZS的生長特性

由圖3可知，菌株10`ZS的最適生長溫度是35 ℃，在25～40 ℃之間生長良好。由圖4可知，菌株10`ZS的最適生長pH為6.0，適宜在pH 5.0～8.0生長。由圖5可知，菌株10`ZS在1%～4%NaCl溶液中正常生長，在6%NaCl溶液中生長相對緩慢。由圖6可知，菌株10`ZS在0.2～0.4 mmol/L的Cu2+溶液中正常生長，在06 mmol/L的Cu2+溶液中生長緩慢。

2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對染料的脫色效果

以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計算，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g。由圖7可知，菌株10`ZS的芽孢漆酶對結晶紫、RBBR、靛紅和活性黑6 h脫色率分別為87.9%、78.5%、161%和14.6%。

3 討論

菌株10`ZS是從東北林業大學實驗林場的樟子松林下的土壤中分離出來的，有芽孢，在pH 5.0～8.0的范圍內均能生長，能夠耐受6% NaCl溶液。這些特性使得這株細菌適用于工業廢水的處理。菌株10`ZS能夠耐受0.6 mmol/L的Cu2+。這是它得以在Cu2+作為篩選劑的培養基中被分離出的原因。以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g，稍低于Bacillus .CLb[11]和Bacillus sp.9BS[12]的芽孢漆酶的活性。

菌株10`ZS的芽孢漆酶在6 h內對三苯甲烷類染料結晶紫和蒽醌類染料RBBR的脫色率較高，分別為87.9%和785%。蒽醌類染料是漆酶的特異底物，可以直接被氧化[13]，而三苯甲烷類染料不是漆酶的特異底物，但是菌株10`ZS的芽孢漆酶則可以直接氧化結晶紫使其脫色，表明菌株10`ZS的芽孢漆酶具有新的功能。綜上所述，菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的性能，在6 h內芽孢漆酶對結晶紫和RBBR具有較高的脫色效果。這表明菌株10`ZS的芽孢漆酶在工業染料廢水的處理中具有潛力。

參考文獻

[1] CLAUS H，FABER G，KNIG H.Redoxmediated decolorization of synthetic dyes by fungal laccases[J].Appl Microbiol Biotechnol，2002，59：672-678.

[2] SANTHANAM N，VIVANCO J M，DECKER S R，et al.Expression of industrially relevant laccases：Prokaryotic style[J].Trends Biotechnol，2011，29：480-489.

[3] DWIVEDI U N，SINGH P，PANDEY V P，et al.Structurefunction relationship among bacterial，fungal and plant laccases[J].J Mol Catal B：Enzym，2011，68：117-128.

[4] FANG Z M，LI T L，CHANG F，et al.A new marine bacterial laccase with chlorideenhancing，alkaline dependent activity and dye decolorization ability[J].Bioresour Technol，2012，111：36-41.

[5] SINGH G，BHALLA A，KAUR P，et al.Laccase from prokaryotes：A new source for an old enzyme[J].Rev Environ Sci Biotechnol，2011，10：309-326.

[6] SHARMA J K，ARORA M K.Decolourization of textile effluent[J].Pollution Res，2001，20：453-457.

[7] DURAN N，DURAN M.Enzyme applications in the textile industry[J].Rev Progress Coloration，2000，30：41-44.

[8] WESENBERG D，KYRIAKIDES I，AGATHOS S N.White rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents[J].Biotechnol Adv，2003，22：161-187.

[9] 沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].3版.北京：高等教育出版社，1999：116-120.

[10] 王遠亮，楊瑞紅，毛愛軍，等.采用未培養技術對荷斯坦奶牛瘤胃細菌多樣性進行初步分析[J].微生物學報，2005，45（6）：915-919.

[11] 李凡姝，劉海洋，戴紹軍，等.高產漆酶菌株Bacillus sp.CLb的篩選及其對染料脫色效果的研究[J].安徽農業科學，2014，42（6）：1614-1616，1654.

[12] 汪春蕾，田菲，張月穎，等.耐鹽Bacillus sp.9BS的篩選及其對染料的脫色效果[J].湖南農業大學學報（自然科學版），2015，41（3）：313-317.

[13] WONG Y，YU J.Laccasecatalyzed decolorization of synthetic dyes[J].Water Res，1999，33：3512-3520.