基于氣相色譜—質譜技術的小青龍湯證大鼠血液代謝組學研究

趙小華 何麗清 蓋江華

摘要：目的 采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）測定小青龍湯證大鼠血液中內源性代謝物，為小青龍湯證本質研究提供依據。方法 將36只雄性Wistar大鼠隨機分為空白對照組10只、模型組13只和小青龍湯組13只，模型組和小青龍湯組制作外寒內飲（小青龍湯證）模型，小青龍湯組灌胃小青龍湯，空白對照組不作任何處理。 15 d后，3組大鼠腹主動脈取血，進行GC-MS檢測。圖譜經預處理后采用偏最小二乘法-判別分析進行多元統計分析。結果 發現13種小分子標志物，分別為乳酸、3-羥基丁酸、甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸、葡萄糖、花生四烯酸等代謝物質。結論 乳酸、甘氨酸等標記物集中表現為能量代謝、免疫功能和炎癥反應，為小青龍湯證本質研究提供了物質基礎。

關鍵詞：氣相色譜-質譜；血液；小青龍湯證；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.023

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0083-04

Metabonomics Study on Blood of Rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome Based on GC-MS ZHAO Xiao-hua1， HE Li-qing1， GAI Jiang-hua2 （1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China；2.Changzhi Chinese Medicine Hospital， Changzhi 046000， China）

Abstract：Objective To determine the endogenous metabolites in blood of rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome by using GC-MS；To provide evidence for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome. Methods Totally 36 male Wistar rats were randomly divided into blank control group （10 rats）， model group （13 rats）， and Xiaoqinglong Decoction group （13 rats）. Model group and Xiaoqinglong Decoction group were used to make the models of exogenous cold and internal fluid syndrome （Xiaoqinglong Decoction Syndrome）. Rats in Xiaoqinglong Decoction group received gavage with Xiaoqinglong Decoction， while rats in blank control group received nothing. Blood of rats in the three groups was taken from the abdominal aorta and detected by GC-MS 15 days later， and analyzed by multivariate statistical analysis with PLS-DA. Results 13 kinds of biomarkers were found：lactic acid， 3-hydroxy-butyric acid， glycine， serine， lysine， dextrose， arachidonic acid and other metabolites. Conclusion Expressions of biomarkers， such as lactic acid and glycine， are energy metabolism， immune function， and inflammation， which provide material basis for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome.

Key words：GC-MS；blood；Xiaoqinglong Decoction Syndrome；rats

小青龍湯首見于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹滿，或喘者，小青龍湯主之”。全方共8味藥，是張仲景治療外寒內飲證的名方。

基金項目：國家自然科學基金（81102538）；山西中醫學院臨床基礎項目（2011JC05）

通訊作者：何麗清，E-mail：hlqyx@163.com

小青龍湯證為外感風寒表邪、內有水飲之氣、內外合邪而表現出的適合服用小青龍湯的癥狀，其臨床表現較多，其中咳嗽、痰多、喘息為小青龍湯證辨證關鍵。盡管對小青龍湯已有較多研究，但對其證本質研究仍有不足。目前，氣相色譜-質譜（GC-MS）技術較為成熟地運用于中醫證候客觀化研究，且在證候動物模型證本質研究中取得一定進展，代謝組學與生理學的聯系更加緊密[1-2]。本研究采用GC-MS測定大鼠血液中內源性代謝物，為小青龍證證本質研究提供基礎。

1 儀器、試藥與動物

氣相色譜-質譜聯用儀（Trace GC-PolarisQ Mass， Thermo Finnigan），DZF-1B型真空干燥箱（上海躍進醫療醫械廠），TGL-6高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機有限公司），KQ2200型數控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），ESJ120-4電子天平（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）。

N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺[MSTFA，含1%TMCS（三甲基氯硅烷）]，美國Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺鹽酸鹽、正庚烷、乙腈均為分析純，北京化工試劑公司；二十四烷，上海索萊寶生物科技有限公司。

內標液：精密稱取1 mg二十四烷，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得0.1 mg/mL二十四烷內標工作液。

Wistar大鼠，雄性，體質量（200±10）g，清潔級，中國醫學科學院中國協和醫科大學動物研究所提供，合格證號SCXK（京）2009-2004。

2 方法

2.1 動物分組、造模與取樣

將36只Wistar大鼠隨機分為空白對照組10只、模型組13只和小青龍湯組13只，飼養于普通級動物房。依據外感風寒表邪、內有水飲之氣，內外合邪病機制作外寒內飲（小青龍湯證）模型：將模型組和小青龍湯組大鼠放置于寒冷環境（控制室內溫度在10 ℃左右）中喂養，每日在低溫環境[（0±4）℃]冷凍1 h，并放入冰水中游泳，水面淹沒大鼠鼻尖時將大鼠撈出，持續4周，同時進寒涼飲食（冷凍飼料及冰水）。空白對照組不做任何處理。小青龍湯組大鼠給予小青龍湯（麻黃9 g，白芍9 g，細辛3 g，干姜3 g，炙甘草9 g，桂枝9 g，五味子9 g，姜半夏9 g，山西中醫學院第二附屬醫院藥房提供）灌胃，連續15 d。將3組大鼠麻醉后腹主動脈取血，存放在-80 ℃冰箱中[4]。

2.2 生物樣品制備

從-80 ℃冰箱中取出血液，解凍，搖勻，取上清液100 ?L，加入250 ?L乙腈，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液150 ?L，氮氣吹干，加入30 ?L甲氧胺（15 mg/mL）吡啶溶液，70 ℃反應1 h。加入50 ?L MSTFA，40 ℃反應90 min。加入500 ?L正庚烷（0.1 mg/mL二十四烷），渦旋1 min，進行GC-MS分析。

2.3 氣相色譜-質譜條件

進樣量：1 ?L；進樣口溫度：260 ℃；離子源溫度：200 ℃；載氣：氦氣；載氣流速：1 mL/min；DB-5MS毛細管柱；不分流進樣。質譜檢測條件：電離方式EI，電子能量70 eV，全掃描模式，50～650 m/z。程序升溫：起始溫度60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升至140 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，保持6 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。

2.4 模式識別分析與統計方法

運用SIMCA-P+軟件進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和建立模型，采用SPSS17.0統計軟件對截荷圖遠端標記物進行分析。數據以—x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血液樣品測定結果

3組血液樣品GC-MS測定所得色譜圖見圖1。各色譜峰分布均勻，峰形較好，且得到很好的分離，模型組和空白對照組直觀可見較多差異峰，如15.11、15.80、27.67、33.17、41.25。說明大鼠造模后體內代謝物發生了明顯變化。

3.2 多元統計分析

分別對空白對照組與模型組、小青龍組與空白對照組血液樣本GC-MS數據進行分析，PLS-DA分析結果見圖2。

從散點圖可以看出，空白對照、模型組分布在t[1]軸兩側，直觀反映了空白對照組與模型組之間有差別，說明造模之后機體的代謝物發生了變化。小青龍湯組接近空白對照組，反映了模型大鼠在服用小青龍湯之后，代謝物明顯接近空白對照組。結合載荷圖、典型的血液圖譜及SPSS軟件分析結果得到這些生物標志物：乳酸、甘氨酸、丁二酸、絲氨酸、賴氨酸、纈氨酸、吡喃半乳糖苷、山梨醇、葡萄糖、花生四烯酸等。以上這些代謝物在用藥后發生明顯變化。

從3組載荷圖結合VIP值（variable importance in the projection，變量重要性投影，可以預測各個數據對模型的貢獻值，VIP>1的意義在于可能為潛在標志物）尋找導致其分開的差異性成分，即小分子標志物，結果共找到13個標志物，見表1。采用SPSS17.0統計軟件對13個標志物進行t檢驗，部分結果見表2。

4 討論

由于GC-MS在具有諸多優點同時，也有不能分析大分子、難揮發性和熱不穩定性物質的缺點，所以，在處理血液樣本同時需要對樣本進行衍生化處理。三甲基硅烷（TMS）衍生化在樣本硅烷化處理的基礎上進行GC-MS檢測，結合PLS-DA有監督的模式識別方法，能夠對樣本進行較好的分析，有利于尋找內源性代謝物的小分子標記物。所以參考文獻[5-7]，本試驗選擇TMS衍生化試劑對血樣進行處理。

血液中的主要代謝產物為氨基酸類、脂肪酸類、有機酸類等，且與機體內多種代謝途徑密切相關。在機體內，任何疾病的發生都會引起其內源性物質發生變化。本研究采用GC-MS技術分析血液中發生顯著變化的代謝物，說明引起小青龍湯證整體代謝變化的情況，尋找小分子標記物，進一步探討小青龍湯證證本質。

其中乳酸在模型組中大量堆積（較空白對照組顯著升高，P<0.01，見表2），造成酸痛、倦怠、發冷、疼痛等。說明模型組機體出現能量代謝異常，解釋了模型組中動物在寒邪上受首先犯肺而出現的機體應激發應。尿素是了解腎臟機能的重要指標，在模型組的血液中尿素升高，說明機體內有毒的含氮代謝物增加，又由于尿素在蛋白質和氨基酸分解過程中，其升高進一步說明模型組的代謝異常，解釋了模型組中動物由于水液代謝障礙，出現的尿量減少、水腫癥狀。葡萄糖、吡喃半乳糖苷較空白對照組下降，3-羥基丁酸較空白對照組升高，均說明模型組能量代謝異常。絲氨酸、賴氨酸均能提高機體免疫力的氨基酸，模型組較空白對照組顯著下降，說明模型組機體的免疫力下降，機體在感受寒邪后，正氣抗邪于外，能量代謝增加，而表現出倦怠等。另外，血液中的花生四烯酸是白三烯的前體，白三烯與支氣管哮喘、慢性支氣管炎的炎癥有密切關系[8-10]。模型組中花生四烯酸明顯升高（與空白對照組比較，P<0.05，見表2），說明機體內有明顯炎癥，小青龍湯組較空白對照組標記物均有不同程度的回調，說明小青龍湯證與炎癥、免疫相關。

核磁共振技術與GC-MS技術同屬于代謝組學研究中的兩大技術。本課題組前期研究中，基于核磁共振技術檢測到了肌酸、乳酸、3-羥基丁酸、天冬氨酸、牛磺酸等十幾種代謝物，數目較少，這與其靈敏度較低、分辨率不高的缺點有關。相對于核磁共振技術，GC-MS技術檢測到了乳酸、3-羥基丁酸、甘氨酸等30多種代謝物，源于其高靈敏度、高分辨率、高通量等優勢。單純氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸等8種。

前期研究中，基于核磁共振技術檢測血液找到的小分子標志物反映小青龍湯證主要與能量代謝、免疫功能、機體應激方面有關[4]。本次基于GC-MS的研究結果，即小青龍湯證證本質與能量代謝、炎癥反應、免疫相關，與前期結果較為一致。另外，本研究在血液檢測中找到了與炎癥相關的標記物花生四烯酸，與免疫功能相關的絲氨酸、酪氨酸，與能量代謝相關的葡萄糖、吡喃葡萄糖等代謝物，更加說明了小青龍湯證的本質所在。

本研究結果從另外一方面對整體代謝上小青龍湯證證本質進行了剖析與探究。為了更好地應用GC-MS這一檢測手段，綜合分析小青龍湯證，找出其本質的小分子標記物，我們將繼續用以分析肝、腎、肺組織，并動態分析尿液，以更加全面闡釋小青龍湯證。

本研究驗證了GC-MS技術這一高通量、高靈敏的分析手段結合PLS-DA模式識別用于證本質研究的可行性，基于機體整體功能性變化檢測方法與中醫的整體理論相結合，通過檢測機體內源性差異代謝物，研究機體代謝途徑，用以區分疾病模型和正常個體，建立疾病經典指標與代謝組學中生物標志物的關系，從而為證候本質研究提供依據。

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（收稿日期：2014-06-29；編輯：陳靜）