補腎膏等院內膏方微生物限度檢查方法的建立

郭紅玲

【摘 要】 目的：建立我院膏方微生物限度檢查方法。方法：根據2010版《中國藥典》規定，對我院補肺膏等10個基礎膏方進行微生物限度檢查方法的驗證。結果：補肺膏、養顏調經膏、糖尿病膏、溫陽培補膏等4種膏方具有一定的抑菌作用，其余6種膏方無抑菌作用。結論：補肺膏、養顏調經膏、糖尿病膏、溫陽培補膏4種膏方采用培養基稀釋法檢查其微生物限度；補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛膏6種基礎膏方用常規平皿法檢查微生物限度。

【關鍵詞】 膏方；微生物限度；方法建立

【中圖分類號】R446.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）11-0007-03

膏方又稱“膏滋”或“煎膏”，是最古老的劑型之一[1] ，多具有滋補，預防與治療作用，特別是對于亞健康與體弱多病者的調養效果顯著。隨著生活水平的不斷提高，人們對健康意識不斷增強，中醫藥養生知識的大量普及[2] ，使膏方在各地區也越來越得到大眾的認可。

目前，各醫院制作的膏方無統一質量控制標準，且文獻對膏方質量控制的報道不多，特別是微生物方面的文獻更少[3] 。然而，醫院膏方的制作多采用手工傳統制作方法，容易受操作器具、原輔料及環境微生物污染，有必要對醫院制作的基礎膏方建立相應的微生物限度檢驗方法，以確保衛生學的安全性。根據2010版《中國藥典》附錄的規定，在藥品進行檢驗前必須進行方法學驗證。故本實驗室根據2010版《中國藥典》一部附錄要求，查閱相關文獻[4-7] ，對我院補肺膏、養顏調經膏、糖尿病膏等10種基礎膏方進行微生物限度檢測方法摸索，建立了我院基礎膏方微生物限度檢驗方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（湖南衡陽金一帆制藥設備實業有限公司）；XPX-150型生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；MJ-160-Ⅱ型霉菌培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；電熱恒溫培養箱（武漢武昌實驗儀器廠）；紫外儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 材料

1.2.1 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 、大腸埃希菌[CMCC（B）22102] 、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501] 、白色念珠菌[CMCC（F）98001] 、黑曲霉菌[CMCC（F）9003] ，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 培養基 膽鹽乳糖增菌液（批號：120627）、玫瑰紅鈉瓊脂（批號：120522）、營養瓊脂（批號120423）、營養肉湯（批號：121205）為北京三藥科技開發公司產品；改良馬?。ㄅ枺?20215）、改良馬丁瓊脂（批號：121025）為杭州微生物試劑公司產品。

2 方法

2.1 菌液的制備 按照2010版《中國藥典》一部附錄ⅫⅠ[7 ] 要求制備。

2.2 供試液的制備 取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數驗證方法（平皿法）

2.3.1 試驗組 取“2.1”項下菌液1ml和“2.2”項下1：10供試液1ml，注入同一直徑為90mm的平皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組 分別取“2.1”中的每一種試驗菌加入培養皿中，注入45°營養瓊脂培養基測定菌液菌落數。將以上制備的培養皿，細菌置于30～35℃培養48小時；霉菌置于25℃培養72h，每日觀察測定菌液菌落數。

2.3.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液1ml，注入培養皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，測定供試品本底菌落數。

2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1ml和“2.2”項下稀釋劑1ml，注入培養皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，測定其菌落數。

2.4 培養基稀釋法

2.4.1 試驗組 取“2.2”項下1∶10的供試液的供試液2ml，每1ml供試液分別等量注入5個平皿中，每10個皿為一組。取“2.1”項下金黃色葡萄球菌菌液1ml，分別注入上述培養皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，置于30～35℃培養48h，測定其菌落數。

2.4.2 菌液組 取“2.1”項下金黃色葡萄球菌試驗菌液1ml加入培養皿中，注入45°營養瓊脂培養基測定菌液菌落數。將以上制備的培養皿，細菌置于30～35℃培養48h，每日觀察測定菌液菌落數。

2.4.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液0.2ml，注入培養皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，測定供試品本底菌落數。

2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1ml和“2.2”項下稀釋劑0.2ml，注入培養皿中，立即傾注45°營養瓊脂培養基15～20ml，測定其菌落數。

2.5 控制菌檢查方法驗證

2.5.1 供試液制備 同“2.2”項下供試液制備。

2.5.1.1 試驗組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1ml注入100ml膽鹽乳糖培養基中，置于35℃，培養18～24h后，取該培養物0.2ml，接種至5mlMUG培養基中，培養，分別于5h、24h置366nm紫外光下觀察有熒光反應，沿試管壁加入數滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色。

2.5.1.2 陰性對照組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的金黃色葡萄球菌陽性菌液1ml注入100 ml膽鹽乳糖培養基中，置于35℃，培養18～24h后，取該培養物0.2ml，接種至5mlMUG培養基中，培養，分別于5、24h置366nm紫外光下觀察無熒光反應，沿試管壁加入數滴靛基質試液，液面呈本色，結果為陰性。

2.5.2 大腸菌群檢查方法驗證

2.5.2.1 供試液制備 取1∶10的溫陽培補膏供試液采用逐級稀釋法，稀釋為1∶100，1∶1000的供試液。

2.5.2.2 試驗組 分別取“2.5.2.1”項下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發酵培養基中，并分別加入“2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1ml，培養18～24h，觀察結果。

2.5.2.3 陰性對照試驗 取稀釋液1ml加入10ml乳糖膽鹽發酵培養基中，培養18～24小時，觀察結果，結果為陰性。

2.5.2.4 供試品檢查 分別取“2.5.2.1”項下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發酵培養基中，按2010版《中國藥典》一部附錄要求操作，觀察結果。

3 結果

3.1 菌數回收率的計算

[HT6”SS][JP3]稀釋劑對照組的菌數回收率（%）=稀釋劑對照組的平均菌落數菌液組的平均菌落數×100%[JP]

[JP4]試驗組菌數回收率（%）=實驗組平均菌落數-共試品對照組平均菌落數菌液組的平均菌落數×100%[JP][HT]

《中國藥典》2010版規定各試驗菌株的回收率（%）均得大于70%。

3.2 常規平皿法驗證結果 用常規平皿法對10種膏方的細菌、霉菌與酵母菌計數的驗證，結果見表1。由表1可知，補肺膏、養顏調經膏、糖尿病膏、溫陽培補膏四種基礎膏方用常規平皿法測定其枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率在70%以下，說明該四種基礎膏方對草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強；改用培養基稀釋法測定，其結果見表2，但白色念珠菌、大腸埃希菌及黑曲霉菌回收率均在70%以上，說明其對這3種菌無抑菌作用，可以用常規平皿法測定這三種膏方的霉菌與酵母菌。補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛膏6種基礎膏方用常規平皿法測定其細菌與霉菌及酵母菌計數驗證回收率均在70%以上，說明可以用常規平皿法對補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、培元固衛膏、兒童健脾開胃膏進行細菌與霉菌及酵母菌的微生物限度測定。

3.3 培養基稀釋法驗證結果 用培養基稀釋法對補肺膏等4種基礎膏方的霉菌及酵母菌計數測定法進行驗證。有表2可知，枯草胞桿菌及金黃色葡萄球菌回收率均在70%以上，說明培養基稀釋法可以用于補肺膏、養顏調經膏和糖尿病膏的微生物限度測定。

3.4 控制菌檢查方法驗證結果 采用2010版《中國藥典》一部附錄方法對10種膏方的控制菌檢查方法進行驗證，結果均符合要求，結果表明可以采用常規法，對我院各膏方進行控制菌微生物限度檢查。

4 討論

中藥膏方是自古以來就有的傳統中藥劑型之一，不僅是單純的補藥，兼有治療和預防，即“祛病糾偏”的雙重療效，集補、調、療的綜合功效[8、9] ，在養生、慢性疾病及治未病方面起到良好的療效。隨著現代人生活節奏的加快，亞健康人群的不斷壯大及養生觀念的不斷加強，冬令膏方在我國越來越受到重視，但關于其質量控制的文獻報道較少，特別是微生物限度測定的更少。因膏方含藥味多，處方量大，在制作過程中可能會受到微生物污染，為了保證其安全，根據2010版《中國藥典》的要求，對我院自制的10種基礎膏方進行微生物限度測定的方法學驗證，建立了我院基礎膏方微生物限度測定的方法。

通過驗證試驗發現，含有清熱解毒類、化痰止咳類中藥材的膏方，因部分藥材本身具有較強的抑菌作用，其加工制備后仍具有一定的抑菌作用。常規平皿法不能直接用于該類膏方的微生物限度測定，而選用培養基稀釋法測定。通過驗證，我院基礎膏方的霉菌與酵母菌檢查法基本都可以采用常規法測定。補肺膏、養顏調經膏、溫陽培補膏、糖尿病膏等膏方的細菌檢查法需采用培養基稀釋法測定?？刂凭鷻z查都可以采用2010版《中國藥典》規定的常規法進行。

通過對膏方微生物限度的測定方法的驗證，制定合適的膏方微生物限度測定方法，確保膏方在制作的過程中不被微生物污染，避免膏方在患者服藥的長期貯存中霉變而變質，保證患者用藥的安全性，為膏方質量控制的制定提供一定的基礎。

參考文獻

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[2] 史紅霞，屠亞軍.膏方在現代臨床中的應用[J].中國社區醫師.醫學專業，2012，13（14）：33.

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[9] 楊志敏，謝東平.顏德馨膏方治療高脂血癥經驗[J].上海中醫藥雜志，2005，39（12）：8-9.