苗藥烏糾不同提取部位的止血活性研究

李春榮　孟鐵宏　王恒

【摘 要】 目的：探討烏糾的止血活性部位，為其止血活性成分的篩選提供線索和依據。方法：用60%乙醇對烏糾原藥材活性成分進行提取，回收乙醇，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯對醇浸膏進行萃取，分別制得相應的部分和水部分。然后通過測定小鼠凝血時間、出血時間和血小板計數(shù)（PLC）等方法考察其活各部分的止血效果。結果：石油醚部分、正丁醇部分、乙酸乙酯部分和水部分均有止血作用，烏糾中石油醚提取物的止血效果最佳。

【關鍵詞】 烏糾；出血；活性部位

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）11-0001-02

苗藥烏糾系鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，又名九倒生、鐵郎雞、地柏枝，主要分布于云南、貴州、四川至山西等地，是貴州苗族居住地區(qū)傳統(tǒng)的民間藥物，其性涼，味微苦，具有活血消腫、止血生肌的作用[1]。目前，鐵角蕨屬植物的化學成分和藥理研究已有相關報道[2]，但關于苗藥烏糾化學成分及止血活性部位的研究還未見報道。本文在對烏糾進行分段提取的基礎上，考察烏糾的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物對小鼠止血活性的實驗，為進一步研究其止血活性成分及止血機制提供指導。

1 材料與方法

1.1 藥材 烏糾：產地貴州黔南、黔東南苗族地區(qū)，經貴陽中醫(yī)學院孫慶文教授鑒定為鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev.）的全草；云南白藥（瓶裝）（批號：ZL13022，云南白藥集團股份有限公司）。

1.2 動物 昆明種小鼠，清潔級，體重（20±2）g，雌雄各半，由貴陽醫(yī)學院試驗動物中心提供，合格證號：SCXK（黔）2002-0001。

1.3 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇均為分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 供試液的制備 取干燥烏糾，粉碎，過20目篩，稱取1000g，于10L圓底燒瓶，用 60%乙醇，80℃下回流提取2.5h，抽濾，平行提取3次，合并抽濾液，濾液經減壓回收乙醇，至無醇味，得到烏糾粗提取物。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收有機溶劑，真空干燥（60℃），制成干浸膏[3]，分別得到石油醚提取物部位、正丁醇提取物部位、乙酸乙酯提取物部位和水提取物部位浸膏，并稱定各提取物，臨用前，用0.1% -CMC配成適宜濃度的溶液。

1.4.2 出血時間（BT）的測定（斷尾法） 取小鼠60只，隨機分為6組，即空白對照組、云南白藥組（即陽性對照組，0.5g/kg）和石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組及水提物組4個給藥組（提取物），試驗小鼠每個給藥組10只，雌雄各半。稱取一定量的提取物用0.1% -CMC配成3g/kg藥劑，分別灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d。末次給藥后30min，小鼠夾固定，將小鼠尾尖0.5cm處橫向切斷，當血液自動流出時開始計時，每隔30s用濾紙吸去血滴1次，到血液不再流出為止（濾紙吸時無血）[4-5]，以人工創(chuàng)面形成到出血停止所用時間作為出血時間。

1.4.3 凝血時間（CT）測定 取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，分組給藥均與1.4.2方法相同，末次給藥后30min，用眼科彎鑷迅速摘去一側眼球即有血液流出，用棉球擦去第一滴血，再于載玻片兩端各滴1滴血，血滴直徑約為5mm，立即記時，每隔30s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，并觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止所需時間即為凝血時間。

1.4.4 小鼠血小板計數(shù)（PLC） 取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，分組給藥均與1.4.2方法相同，末次給藥后30min，用毛細取血管在小鼠眼內眥球采血10μL用血小板稀釋液稀釋100倍，普通光學顯微鏡下計數(shù)（PLC）。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據采用SPSS 20.0軟件進行分析處理，數(shù)據以（x[TX-*3]±s）表示，對數(shù)據進行雙樣本t檢驗和方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 對小鼠出血（BT）時間的影響 與空白生理鹽水組比較，烏糾的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、水提取部位和云南白藥組均能顯著縮短小鼠出血時間，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中水提取部位的效果最佳，出血時間為（93.75±37.39）S。

2.2 對小鼠凝血時間（CT）的影響 和空白生理鹽水組對比，石油醚提取部位、正丁醇提取能明顯縮短小鼠凝血時間，并且有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而乙酸乙酯提取物部分對小鼠凝血時間效果不明顯。小鼠凝血時間見表2。

2.3 對小鼠血小板計數(shù)（PLC）的影響 由表3可見，與空白生理鹽水組比較，烏糾的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物均能顯著加快血小板的凝聚作用，其促凝作用最大的為乙酸乙酯部位，其中水提取物部分的效果最佳。

3 討論

小鼠斷尾出血時間和玻片凝血時間由于方法直觀，操作簡便，廣泛用于止血中藥活性的篩選。出血時間是指皮膚受特殊刺破后出血并自動停止所需的時間，常用于評價皮膚毛細管的止血能力，也是觀察受試藥物對凝血機制有無影響的第一步[8]。實驗結果表明，烏糾提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提取部位均能顯著縮短小鼠出血時間；凝血時間是指血液離開機體后到完全凝固所需要的時間，它的長短反映血液中參與凝血的各種凝血因子的含量以及它們的功能，其中血小板的數(shù)量和功能以及毛細血管功能是決定性因素，在凝血時間的實驗中，只有乙酸乙酯部位對小鼠凝血效果不明顯，石油醚、正丁醇和水提取物均對小鼠凝血效果明顯，且能有效降低小鼠的血小板數(shù)量。石油醚部位的出血時間、凝血時間與云南白藥的實驗數(shù)據接近，說明烏糾提取物中石油醚部位的止血效果最好，其凝血活性成分、凝血機制有待進一步研究。

根據出血時間（BT）和凝血時間（CT）實驗結果發(fā)現(xiàn)，烏糾的石油醚部位和水提取部位具有良好的止血和凝血活性，證明了苗藥烏糾是一味止血良藥，也為進一步探究苗藥烏糾的止血活性成分分析及止血機制奠定了基礎。

參考文獻

[1]王玲，何兆榮.藥用蕨類植物化學成分研究進展[J].中國野生植物資源，2006，3（10）：25-26.

[2]于永明.披針觀音座蓮和半邊鐵角蕨的化學成分及生物活性研究[D].中國醫(yī)學科學院博士學位論文，2009：21-38.

[3]王樹松，王曉嵐.柿葉止血成分的實驗研究[J].河北中醫(yī)，2005，27（1）：6-68.

[4]石磊，李昌勤，廉婷婷，等.見血飛對小鼠出血時間和凝血時間的影響[J].中國藥房，2010，21（47）：2243-2244.

[5]吳久健，孟岳良，鄒麗華，等.白及不同提取部位對小鼠止血活性實驗[J].藥學實踐雜志，2011，29（3）：206-208.

[6]劉晨，柳佳，鄭傳柱，等.側柏炭止血作用活性部位篩選[J].中國中藥雜志，2014，39（16）：2152-2157.

[7]石朗，杜冰，張婷婷，等.雞冠花不同提取部位止血作用研究[J].醫(yī)藥導報，2013，32（9）：1122-1124.

[8]梅興國，萬國暉，周國強，等.火棘提取物對血液凝固的影響[J].中藥材，2001，24（12）：874-875.

（收稿日期：2015.04.06）