半夏瀉心湯及其拆方對胃電節律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達的影響

李翠等

摘要：目的 探討半夏瀉心湯調節胃運動的配伍規律。方法 選取90只健康SD雄性大鼠，分為正常組10只和模型組80只。復制大鼠胃電節律失常模型，經胃電生理學指標評價后，根據半夏瀉心湯的配伍特點，將其拆分為辛開、苦降、甘補、辛開苦降、辛開甘補、苦降甘補組，每組10只。各給藥組按相同藥物濃度不等體積連續灌胃4周。給藥后進行胃電參數分析，采用免疫組化法、RT-PCR檢測胃組織Cx43及其mRNA表達。結果 與正常組比較，模型組Cx43及其mRNA表達升高；與模型組比較，各給藥組胃電慢波頻率變異系數降低，各給藥組Cx43及其mRNA表達降低，其中辛開甘補組作用最為顯著。結論 半夏瀉心湯調節胃運動機制可能與其降低縫隙連接蛋白Cx43及其mRNA表達有關，從而改變紊亂的胃電節律，達到改善胃運動功能的作用。

關鍵詞：半夏瀉心湯；Cx43蛋白；縫隙連接；胃運動；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0075-05

胃腸道運動功能紊亂是大多胃腸道疾病的重要臨床表現和發病機制，其發病率高。半夏瀉心湯出自《傷寒論》，具有降逆止嘔、消痞散結的作用。前期研究表明，半夏瀉心湯對胃電節律失常大鼠胃壁SCF基因表達水平、胃肌間神經叢c-kit陽性間質細胞（ICC）含量表達均有影響[1]。胃腸神經-ICC-平滑肌細胞（SMC）網絡結構和功能的變化對胃腸道動力障礙性疾病有重要的病理生理學意義。在胃腸道中，縫隙連接（GJ）是介導SMC和ICC細胞間電化學信息交流，保證肌肉活動的協調性和同步性的特殊通道。Cx43是構成GJ最重要的連接蛋白，廣泛存在于胃腸Cajal與SMC之間。Cx43基因發生突變、數量減少，會影響細胞膜上GJ通道的數量，從而妨礙細胞間信號的傳遞，導致胃腸道運動功能障礙。本研究以Cx43為切入點，根據半夏瀉心湯辛開苦降甘補的配伍特點，按照藥味特點與中醫病機結合分組的原則，采用析因實驗設計研究半夏瀉心湯及其拆方對ICC細胞Cx43的影響，進一步揭示半夏瀉心湯調節胃運動的分子機制，闡釋經方配伍規律。

1 實驗材料

1.1 動物

健康4周齡SD雄性大鼠90只，體質量（180±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號0309256。所有動物均給予大鼠全價營養顆粒飼料，飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障動物實驗室。

1.2 藥物

半夏瀉心湯方的藥物劑量比例按文獻[2]換算。法半夏55.7 g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g，黃連15.62 g，大棗42 g。根據“法依病機，拆方依法”的研究思路[3]，將半夏瀉心湯拆分為辛開組（法半夏、干姜）、苦降組（黃芩、黃連）、甘補組（人參、炙甘草、大棗）、辛開苦降組（法半夏、干姜、黃芩、黃連）、辛開甘補組（法半夏、干姜，人參、炙甘草、大棗）及苦降甘補組（黃芩、黃連、人參、炙甘草、大棗）。所有藥物均為免煎顆粒，北京康仁堂藥業有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫組化通用試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；一抗Connexin43 Antibody（鼠抗人，單克隆抗體）、二抗goat anti- mouse IgM-HRP，Santa cruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索萊寶公司；異丙醇，北京益奧明科技有限公司；反轉錄試劑盒，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix，ABI公司；所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。多導生理儀EGG100C（BioPac公司，美國），SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統（Diagnostic instruments，美國），LD5-2A離心機（北京京立離心機有限公司），超聲勻漿機（Pharmacia Biotech），紫外分光光度儀（Pharmacia，美國），實時熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為正常組和模型組。正常組10只，常規飼養。模型組80只，不規則喂養4周，即大鼠每逢單日正常進食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節律。自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10 mol/L鹽酸10 mL），以破壞胃內酸堿環境，制備大鼠胃電節律失常模型[4]。大鼠不規則喂養4周后，參考文獻[4]進行胃電生理學評價，分析胃電慢波節律。模型大鼠胃電節律異常，胃動過速、胃動過緩和節律紊亂，與正常組比較有顯著差異，提示造模成功。將標記好的80只模型大鼠隨機分為模型組、辛開組、苦降組、甘補組、辛開苦降組、辛開甘補組、苦降甘補組、全方組，每組10只。相當于人單位體質量原藥材量的10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。各給藥組每日按相同藥物濃度不等體積（5 mL/kg）給予相應藥液灌胃，每日1次，連續4周。正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 胃電生理學評價

給藥4周后，大鼠禁食18 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，固定后腹部備皮，常規消毒，于劍突下正中切開腹壁1～2 cm，暴露胃竇部，在距幽門0.5 cm處漿膜下埋置一對Ag-AgCl電極，兩電極間距3 mm，還原暴露的胃組織，接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。將三股電極連接于多導生理儀上。打開Acqknowledge4.1，胃電橫軸時間以1 min為單位，縱軸振幅以2 mV為單位進行胃電記錄，每次記錄30 min。胃電記錄完畢，用2/0縫合線縫合切口，碘伏擦拭。術后大鼠腹腔注射青霉素40萬U/（d·只），連續3 d。術后1周取材。胃電記錄以每10 min為1個時間段，計算每只大鼠每個時間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數[4]，進行胃電參數分析。

2.3 免疫組織化學法檢測胃組織Cx43表達

大鼠禁食18 h后，3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。采用SABC免疫組化檢測法胃組織Cx43表達，具體步驟按照試劑盒說明書進行。采用SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標本隨機選擇肌間神經叢的5個最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達分布情況，結果進行半定量分析，檢測平均光密度值，計算積分光密度值（IOD）。以細胞質有明確棕色或棕黃色著色而細胞核無著色為陽性表達。

2.4 RT-PCR檢測大鼠胃壁Cx43基因表達

取胃組織30 mg，置于冰上，加Trizol勻漿，按照常規操作順序提取總RNA，紫外分光光度計檢測OD260和OD280，計算總RNA的濃度及純度。取2 μg總RNA，在鳥類成髓細胞瘤反轉錄酶（AMV）和Oligo（dT）條件下進行反轉錄，70 ℃×10 min，4 ℃×5 min，42 ℃×30 min，95 ℃×5 min，4 ℃×5 min，獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應，反應體系為20 μL，含2 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，5×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL。

根據文獻[5]設計引物。Cx43引物序列：上游5'-ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC-3'，下游5'-CATGTCTGG GCACCTCTCTTT-3'，產物長度80 bp；以GAPDH作為內參照。上游5'-GCTCTCTGCTCCTCC CTGTTCTAGA-3'，下游5'-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3'，產物長度95 bp。2條引物擴增效率均為90%～100%。GAPDH、Cx43擴增條件為：95 ℃×5 min預變性；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，40個循環；95 ℃×1 min，55 ℃×30 s，95 ℃×30 s，1個循環。

每個樣品設立3個復孔，取均值。將所得Ct值按照2-ΔΔCt的方法進行均一化處理后進行統計學分析。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據用—x±s表示，所有數據剔除隨機誤差及人為因素導致的過高或過低的測量值，隨后進行正態性檢驗，非正態分布時，采用非參數K個獨立樣本檢驗；服從正態分布時，進行方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊采用非參數檢驗；各給藥組與模型組比較采用Dunnett's T3檢驗；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey's Multiple Comparison Test檢驗；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃電慢波頻率變異系數的影響

如圖1所示，正常組大鼠胃電節律正常，模型組大鼠胃電節律異常，胃動過速或過緩，節律紊亂。模型組大鼠胃電慢波頻率變異系數最大，與正常組比較差異有統計學意義（P<0.05），各給藥組胃電節律均有不同程度改善，胃電慢波頻率變異系數低于模型組，各組慢波頻率變異系數為辛開苦降組<辛開甘補組<全方組<甘補組<苦降甘補組<苦降組<辛開組<模型組，但僅全方組、甘補組、辛開苦降組、辛開甘補組與之比較差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），見表1。提示半夏瀉心湯及其拆方各組具有不同程度糾正胃電節律失常的作用。

4.2 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃組織Cx43表達的影響

Cx43陽性表達為環形肌層間夾雜的深淺不同的棕黃色著色，Cx43陽性表達水平用IOD表示，IOD值越高其陽性表達水平越高，即Cx43蛋白含量越高。與正常組比較，模型組、各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達增高，Cx43 IOD值增高，其中模型組肌間神經叢Cx43陽性表達最為密集，且圖片顯示分布不均勻，并以環形肌之間為多，模型組陽性表達IOD值顯著增高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達降低，Cx43 IOD值降低。各給藥組中，辛開甘補組Cx43表達顯著降低，散在分布于肌層間。各組胃組織Cx43陽性表達排序為：辛開甘補組<甘補組<辛開苦降組<辛開組<全方組<苦降甘補組<苦降組<模型組。見表2、圖2。

4.3 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃組織Cx43 mRNA表達的影響

模型組大鼠胃組織Cx43 mRNA表達明顯高于正常組（P<0.05）；各給藥組Cx43 mRNA表達均低于模型組（P<0.001），其中苦降組、甘補組、辛開苦降組、全方組、辛開甘補組、苦降甘補組與之比較，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。析因分析結果顯示，各給藥組間無明顯差異，甘補組在全方配伍中起主要作用，各給藥組間不存在交互作用。見表3。

5 討論

胃運動功能障礙可歸屬于中醫“痞證”范疇，半夏瀉心湯為治療痞證的經典方，研究其調節胃運動的分子機制對進一步闡明胃腸道運動功能障礙機制具有重要意義。對胃電節律失常引起的胃運動功能亢進，半夏瀉心湯及其拆方是否有調節作用及其相應作用機制，目前尚未見相關文獻研究。胃電節律的改變與Cajal間質細胞表達的減少或增加密切相關，胃壁Cajal數量表達是否正常對調節胃運動至關重要。ICC、胃腸神經以及SMC間可形成網絡狀連接。胃腸神經-ICC-平滑肌網絡是胃腸動力的基本功能單位，可以傳導電興奮，介導神經遞質的產生和調節，對揭示多種胃腸道功能障礙性疾病的發病機制具有重要作用，這種細胞網絡即通過GJ實現。

Cx43是構成GJ最重要的連接蛋白，與胃腸運動有密切關系。修復ICC和促進ICC的再生能夠上調Cx43蛋白的表達，增加神經纖維的數目，從而保持胃腸神經-ICC-SMC網絡結構的完整，恢復胃腸動力[6]。有研究表明，糖尿病胃輕癱大鼠胃縱肌層內ICC分布減少，環形肌內Cx43的表達下降，而補充胰島素可逆轉糖尿病大鼠ICC、Cx43病變從而改善胃動力障礙[7]，提示Cx43表達增高對胃運動有促進作用。因此，通過探究Cx43在胃腸運動障礙性疾病中的作用機制，對進一步揭示半夏瀉心湯治療胃電節律紊亂的作用機制，探究經方配伍規律意義較大。

本實驗結果表明，模型組與正常組比較慢波頻率變異系數顯著增高，各給藥組與模型組比較慢波頻率變異系數有不同程度降低，提示半夏瀉心湯及其各拆方組具有調節胃電節律的作用。電節律紊亂的模型組其Cx43在胃組織上的分布表達顯著高于正常組，且分布不均勻，提示胃電節律紊亂引起的胃動過速可能與Cx43異常增高表達有密切關聯。半定量分析結果顯示，各給藥組均對Cx43表達量有不同程度降低作用，辛開甘補組Cx43陽性表達顯著降低。各給藥組與模型組比較，Cx43陽性表達均有不同程度的降低，提示各給藥組對胃組織縫隙連接Cx43的表達分布均具有不同程度降低作用。

本實驗結果還表明，半夏瀉心湯及其拆方干預可以影響Cx43 mRNA的表達，各給藥組都可以有效降低胃組織Cx43 mRNA的異常增高表達，其中苦降甘補組對Cx43 mRNA的抑制最顯著，提示半夏瀉心湯組方抑制Cx43 mRNA表達，主要通過苦降藥物與甘補藥物的協同配伍來實現。相關研究表明，采用苦寒瀉下法建立的大鼠脾氣虛模型，胃肌層Cx43表達降低[8]，也提示苦瀉藥物對Cx43的表達有抑制作用。綜合上述結果，模型組慢波頻率變異系數增高，Cx43表達增強，基于Cx43表達增高對胃腸運動有促進作用。因此，我們推測Cx43表達異常增高會誘導胃電節律紊亂引起胃動過速，從而導致胃運動功能亢進。半夏瀉心湯通過辛開、苦降、甘補藥物協同配伍作用從而降低Cx43的表達。由此我們推測半夏瀉心湯方不僅能治療胃動過緩導致胃運動功能障礙的心下痞證，還能通過抑制Cx43過表達有效抑制胃電節律紊亂引起的胃動過速，從而改善胃運動功能亢進癥狀，對胃運動功能起雙向調節的作用。各拆方組間協同作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 李宇航，王慶國，陳萌，等.半夏瀉心湯對胃電節律失常大鼠胃壁SCF基因表達水平的影響[J].中醫藥學刊，2003，21（11）：1825-1826.

[2] 柯雪帆，趙章忠，張玉萍，等.《傷寒論》和《金匱要略》中的藥物劑量問題[J].上海中藥雜志，1983，20（12）：36-38.

[3] 李宇航，王慶國，牛欣，等.半夏瀉心湯配伍意義的拆方研究——調節胃分泌作用的實驗觀察[J].北京中醫藥大學學報，1999，22（5）：49-52.

[4] 李宇航，王慶國，陳萌，等.半夏瀉心湯及其拆方對胃電節律失常大鼠胃電慢波頻率變異系數的影響[J].中國中西醫結合雜志，2006，26（S1）：53-55.

[5] Rachdi L， El Ghazi L， Bemex F， et al. Expression of the receptor tyrosine kinase kit in mature β-action and in the pancreas in development[J]. Diabetes，2001，50（9）：2021-2028.

[6] 郭璇，譚華梁，王小娟，等.舒胃湯對功能性消化不良大鼠Cx43蛋白的分布及Cajal間質細胞的修復與再生的影響[J].中國中西醫結合消化雜志，2014，22（11）：652-661.

[7] 吳泉霞，趙勱，譚至柔，等.糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Cajal間質細胞和縫隙連接蛋白43的變化及胰島素的干預作用[J].世界華人消化雜志，2014， 22（29）：4399-4405.

[8] 李冉，齊清會，謝明征，等.香砂六君子湯對脾氣虛證大鼠胃Cajal間質細胞、縫隙連接損傷的修復作用研究[J].中國中西醫結合雜志，2014， 34（10）：1216-1219.

（收稿日期：2015-01-07）

（修回日期：2015-02-05；編輯：華強）