山萸肉不同倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間與5—羥甲基糠醛含量的相關(guān)性研究

于莉等

摘要：目的 針對(duì)山萸肉因倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間長(zhǎng)而引起色澤改變的現(xiàn)象，研究山萸肉倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間與5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量的相關(guān)性。方法 收集倉(cāng)儲(chǔ)0、1、2、3、4年的山萸肉，采用高效液相色譜法，測(cè)定5-HMF含量。結(jié)果 建立了山萸肉中5-HMF的含量測(cè)定方法，倉(cāng)儲(chǔ)0、1、2、3、4年的山萸肉色澤由紅色、黯紅色、紅褐色到褐色，5-HMF的含量從未檢測(cè)出上升到0.292 8%；色澤為黑色的酒萸肉中5-HMF含量為0.954 4%～1.837%。結(jié)論 山萸肉色澤的加深與5-HMF的生成具有相關(guān)性。隨著倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，山萸肉的色澤逐漸加深，5-HMF的含量顯著升高。建議山萸肉的倉(cāng)儲(chǔ)期為1年。

關(guān)鍵詞：山萸肉；5-羥甲基糠醛；色澤；倉(cāng)儲(chǔ)；高效液相色譜法；麥拉德反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0095-04

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，秋末冬初果皮變紅時(shí)采收果實(shí)，用文火烘或置沸水中略燙后，及時(shí)除去果核，干燥而得。山茱萸經(jīng)除去雜質(zhì)和殘留果核后統(tǒng)稱山萸肉，山萸肉經(jīng)酒燉法或酒蒸法燉或蒸至酒吸盡為酒萸肉[1]。新鮮的山萸肉呈紅色，在常溫倉(cāng)庫(kù)中隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色澤會(huì)逐漸加深，可從紅色變?yōu)轺黾t色、紅褐色至褐色，酒萸肉則為黑色。

5-羥甲基糠醛（5-HMF）是從山茱萸炮制品中分離獲得的活性成分，為補(bǔ)肝益腎的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[2]。研究表明，5-HMF是糖類成分與蛋白質(zhì)或氨基酸在一定溫度、濕度條件下，發(fā)生麥拉德（Maillard）反應(yīng)而生成的主要產(chǎn)物之一[3-4]。伴隨的主要現(xiàn)象是食品和中藥材色澤由淺到深[5]。隨著中藥材色澤的逐漸加深，5-HMF含量快速升高，這種現(xiàn)象往往更多出現(xiàn)在加熱過程中[6]。目前，包括5-HMF在內(nèi)的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的藥理和毒理作用存在較多爭(zhēng)議[7]。《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)蜂蜜中的5-HMF進(jìn)行了含量限度規(guī)定，也有學(xué)者對(duì)牛膝提出了5-HMF的限量建議[8]。本研究通過對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)0、1、2、3、4年的山萸肉樣品中5-HMF含量進(jìn)行測(cè)定，探討山萸肉色澤變化與5-HMF含量的關(guān)系，為山萸肉的倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），KQ-100E超聲波清洗器（100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司），Sartorius BP211D型電子天平（感量0.000 1 g，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），XS105 DualRange型電子分析天平（感量0.000 01 g，Mettler Toledo儀器系統(tǒng)有限公司），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

5-HMF對(duì)照品（純度≥99%，批號(hào)BCBF6127V，美國(guó)Sigma-Aldrich公司），甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。山茱萸樣品經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所巢志茂研究員鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（15∶85，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取5-HMF對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.233 4 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取山茱萸樣品，粉碎，取粉末0.2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇（V/V）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。HPLC測(cè)定結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取5-HMF對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，配制成0.00002112、0.0001056、0.000528、0.00264、0.0132、0.0264、0.0528、0.0792、0.1056 mg/mL的溶液，依次分別進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=7735907X-1060（r2=1.000 0），5-HMF在0.0002112～1.056 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（0.116 7 mg/mL）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定5-HMF峰面積值，計(jì)算RSD=0.28% （n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（4號(hào)樣品），室溫放置，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定5-HMF峰面積值，計(jì)算RSD=1.83%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品（4號(hào)樣品）粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得5-HMF平均含量為9.860 mg/g，RSD=1.94%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一供試品（4號(hào)樣品）粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入5-HMF對(duì)照品儲(chǔ)備溶液4.5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定5-HMF含量，計(jì)算平均回收率為102.17%，RSD=2.15%，見表2。

2.9 檢測(cè)限及定量限

在上述條件下，將5-HMF對(duì)照品儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋并測(cè)定，確定檢測(cè)限（S/N=3）為2.918×10-4 ng，定量限（S/N=10）為9.725×10-4 ng。

2.10 樣品含量測(cè)定

取山茱萸樣品，每批平行2份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將峰面積代入回歸方程中計(jì)算5-HMF含量（平均值），結(jié)果見表3。可見，0、1年常溫貯存后，樣品中不含5-HMF，但隨著倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)到2、3、4年，樣品色澤逐漸加深，伴隨5-HMF含量顯著升高。

3 討論

由于Maillard反應(yīng)在加熱條件下更容易發(fā)生，在考察提取方法時(shí)，應(yīng)盡量回避加熱處理。因此，本研究采用了超聲提取法，而不采用水浴回流提取法[9-10]。

本試驗(yàn)分別考察了甲醇（80%、50%）、乙醇（100%、80%）的超聲提取效果，結(jié)果表明，80%甲醇提取時(shí)， 5-HMF峰面積最大，且干擾較少。同時(shí)，對(duì)超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）進(jìn)行了考察，結(jié)果隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，5-HMF峰面積逐漸增大，當(dāng)超聲50 min時(shí)，5-HMF的峰面積增加不明顯。故采用80%甲醇超聲提取50 min。

在收集的18份山茱萸樣品中，4份為酒萸肉，酒萸肉中5-HMF含量顯著高于所有山萸肉樣品，最高含量為1.837%。該結(jié)果與酒制加熱過程中發(fā)生Maillard反應(yīng)有直接的相關(guān)性[6]。

在收集的14份山萸肉樣品中，當(dāng)年秋末收獲同年11月份測(cè)定的0年樣品有2份，倉(cāng)儲(chǔ)1年的樣品有6份，倉(cāng)儲(chǔ)2、3、4年的樣品均為2份。從含量測(cè)定結(jié)果可以看出，未經(jīng)倉(cāng)儲(chǔ)的0年樣品和倉(cāng)儲(chǔ)1年的樣品均未檢測(cè)到5-HMF，而倉(cāng)儲(chǔ)2年以上的山萸肉樣品中均檢測(cè)到了5-HMF，且隨著倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，5-HMF的含量逐漸升高。因此，我們建議山萸肉的倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間為1年。這與山茱萸中馬錢苷的含量從第0年到第5年逐漸下降[11]，但在第1年內(nèi)穩(wěn)定，因而確定儲(chǔ)存期為1年的結(jié)論[12]相符。另外，該現(xiàn)象也可闡釋同為山萸肉樣品，既有未檢測(cè)出5-HMF者[13]，也有含量為0.06%～0.24%[14]、0.009%～0.011%[15]的報(bào)道，其原因可能在于倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間不同。

本研究結(jié)果顯示，倉(cāng)儲(chǔ)0、1年的山萸肉均為紅色，未能檢測(cè)出5-HMF，而倉(cāng)儲(chǔ)了2、3、4年的山萸肉色澤依次加深為黯紅色、紅褐色、褐色，5-HMF含量逐漸升高，差異非常明顯，色澤為黑色的酒萸肉中5-HMF含量則上升到0.954 4%～1.837%，呈現(xiàn)出5-HMF含量隨色澤加深而逐漸升高的規(guī)律。同時(shí)也可說明，5-HMF不僅能夠通過加熱產(chǎn)生，在常溫倉(cāng)儲(chǔ)條件下也可逐漸生成，說明Maillard反應(yīng)在不加熱條件下也可緩慢進(jìn)行。這種在常溫下伴隨色澤的加深而出現(xiàn)5-HMF產(chǎn)生和增加的現(xiàn)象也見于牛膝的研究報(bào)道[8]。因此，我們建議對(duì)生品山茱萸進(jìn)行5-HMF的限量檢測(cè)。

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（收稿日期：2014-12-25）

（修回日期：2015-01-13；編輯：陳靜）