星點設計—效應面法優選治前膠囊的提取工藝

鄒龍等

摘要：目的 優選治前膠囊的提取工藝，為將該制劑開發成中藥新藥提供依據。方法 以浸泡時間、加水量、提取時間為主要影響因素，以浸膏得率和秦皮乙素浸出量為評價指標，采用單因素試驗和星點設計-效應面法優選治前膠囊的最佳提取工藝。結果 優選的最佳提取工藝條件為：回流提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。結論 優選的最佳提取工藝條件對秦皮乙素提取效率高，經濟、合理、簡單可行。

關鍵詞：治前膠囊；星點設計-效應面法；提取工藝；秦皮乙素

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0083-04

前列腺炎是男科臨床常見的難治性泌尿系統疾病，嚴重影響患者的生活質量，因此治療前列腺炎的方藥研究越來越受到重視。治前膠囊由紫花地丁、千里光、金銀花等藥味組成，在沅陵縣中醫男性病醫院（省級重點?？?不育不孕?？漆t院）使用20余年，療效確切。方中紫花地丁為君藥，清熱解毒、涼血消腫，具有明顯的抗菌、抗病毒、消炎作用，現代研究表明秦皮乙素為其主要藥效成分[1]，對治療細菌性前列腺炎有很好的療效。目前，對于提取工藝的研究多采用正交試驗法，易忽略多個因素面間的相互影響，降低了提取效率。本試驗以浸膏得率、秦皮乙素浸出量為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用星點設計-效應面法優選該方最佳水提工藝方法，準確度高，預測指導性更強，為將治前膠囊開發成中藥新藥提供試驗依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（紫外可變波長檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站）；Welchrom- C18柱；AR124CN電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；RE-52C旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HH-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

紫花地丁、金銀花、千里光、魚腥草、知母（湖南君昊中藥飲片科貿有限公司，批號130901，經湖南中醫藥大學藥學院鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，符合2010年版《中華人民共和國藥典》規定）；秦皮乙素對照品（供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號110741-200506）；甲醇為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 秦皮乙素含量測定

2.1.1 色譜條件 Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），甲醇-0.1%磷酸水溶液（19∶81）為流動相，檢測波長為349 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃[2-3]。

2.1.2 對照品溶液的制備 取秦皮乙素對照品15 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取提取液，配制成50%甲醇溶液，3000 r/min 離心15 min，取上清液，即得。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取濃度分別為3.1、6.2、12.4、18.6、24.8、31.0、62.0 μg/mL的對照品溶液10 μL進樣，測定秦皮乙素峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=34.684X-11.13（r2=0.999 7），秦皮乙素在0.031～0.620 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液，重復進樣6次，測定秦皮乙素峰面積。結果RSD=0.30%，說明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批藥材，按“2.1.3”項下方法，平行6份，測定秦皮乙素峰面積。結果RSD=0.72%，說明本方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，測定秦皮乙素峰面積，RSD=0.61%，說明供試品在12 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的提取液樣品5 mL，共6份，分別精密加入秦皮乙素對照品溶液2.5 mL，按“2.1.3”項下方法制備，吸取10 μL，注入色譜儀，測定。結果秦皮乙素的平均加樣回收率為100.51%，RSD=2.12%，說明供試品回收率良好。

2.1.9 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1。

2.2 優選最佳提取工藝

2.2.1 提取次數的選擇 因提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，因此采用單因素試驗[4]進行選擇。按處方量稱取紫花地丁30 g、魚腥草30 g、金銀花30 g、千里光30 g、知母20 g，加10倍量水提取3次，每次2 h，濾過，合并前2次提取液，按“2.1.3”項下方法制備，測定前2次合并提取液與第3次提取液中秦皮乙素的含量和浸膏得率（見表1）。結果表明，提取2次的秦皮乙素浸出量已超過90%，從節約生產成本的因素考慮，將提取次數定為2次。

2.2.2 試驗設計與結果 根據單因素試驗結果，選取浸泡時間、加水量、提取時間3個考察因素，每個因素設5個水平，并以浸膏得率和秦皮乙素浸出量為指標，兩指標所占百分比分別為40%、60%，進行綜合評分，對總分進行方差分析。用星點設計三因素五水平[5]安排試驗（見表2），試驗設計及結果見表3，采用design-expert軟件對試驗結果進行統計學處理，方差分析見表4。

2.2.3 模型擬合與方差分析 采用design-expert 7.0.0軟件處理數據，以綜合評分為指標進行二項式擬合，得到二項式擬合方程R=74.85+0.70A+19.21B+4.45C+0.72AB+0.36AC-1.83BC+1.60A2-4.98B2+2.89C2（r2=0.980 5）。結果表明，多元二項式擬合方程相關系數較高，擬合效果較好。其中，A、B、C、A2、B2、C2項為三因素的單獨影響，而AB、AC、BC項為因素間的交互作用。采用ANOVA分析效應面回歸參數，由表4可知，A（浸泡時間）沒有顯著影響，B（加水量）、C（提取時間）有極顯著影響，所有交互項沒有顯著影響。二項式回歸方程失擬項沒有顯著差異，擬合項差異極顯著，說明模型的擬合效果很好，可以對不同條件下的提取工藝進行預測。

2.2.4 效應面優化、預測與驗證 根據二次多項式模型，繪制三因素綜合評分與各因素間的三維效應面圖，見圖2。

采用design-expert軟件對模型進行優化，根據各因素水平的范圍，選擇效應值極大值，篩選得到最佳的提取工藝條件：浸泡時間1.59 h，加水量18.76倍，提取時間4.69 h，此時綜合評分預測值為97.85?？紤]到生產實際及浸泡時間沒有顯著影響，對各因素進行調整，確定最佳的提取工藝條件：浸泡時間0 h，提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水，提取2 h。

在選取的最佳工藝條件下，按處方量稱取紫花地丁30 g、魚腥草30 g、金銀花30 g、千里光30 g、知母20 g，平行進行3次驗證試驗（見表5），進行理論值與實測值的比較：理論值為97.85，實測值為99.09，偏差率[（實測值-理論值）÷理論值×100%]為1.27%，表明所建立的數學模型具有良好的預測性[6]，所選的最佳工藝條件重現性好。

3 討論

目前針對制劑提取工藝的研究多數采用正交設計的方法，考察的是線和線之間的關系，對面間的關系考察不足，沒有考慮到各因素間的相互作用，但在實際生產過程中，各因素間往往存在著較大的共同作用[7]。星點設計試驗是在單因素試驗的基礎上建立的，確定中心點，避免最佳值與預測值間的偏離，且考慮到了面和面間相互的影響作用，對優選最佳工藝條件的預測性好。采用design-expert軟件對試驗進行安排，對數據進行處理，簡單方便，可信度高，與正交設計、均勻設計相比更加直觀、全面。

本試驗采用星點設計-效應面法優選治前膠囊的最佳提取工藝，以浸泡時間、加水量、提取時間為主要影響因素，以浸膏得率、秦皮乙素浸出量為評價指標，對各指標進行加權綜合評分，對面間的關系進行考察，充分考慮到了各因素之間的相互影響。最終確定治前膠囊的最佳提取工藝條件為：回流提取2次， 第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。結果表明，本工藝方法簡單可行、經濟、合理，對秦皮乙素的提取效率高，適用于工業化生產。

參考文獻：

[1] 胥愛麗，江潔儀，羅文匯，等.HPLC法測定紫花地丁配方顆粒中秦皮乙素的含量[J].江西中醫藥，2013，44（3）：61-62.

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[3] 王冬萍，周建華，蔣慧.HPLC法測定二丁片中秦皮乙素的含量[J].中國保健營養，2012，22（10）：1566-1567.

[4] 陳衛衛，馮看，彭晶蕊.星點設計-效應面法優選抗炎退熱顆粒的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（9）：41-43.

[5] 涂瑤生，李紹林，孫冬梅，等.星點設計-效應面法優選苦參提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：34-37.

[6] 劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現代應用藥學，2007，24（6）：455-457.

[7] 歐陽小光，楊璐.星點設計-效應面法優選五味子提取工藝[J].中國中醫藥信息雜志，2012，19（4）：58-60.

（收稿日期：2014-10-28；編輯：陳靜）