大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3表達的調節作用

齊文杰等

摘要：目的 探討重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3（AQP3）的表達及大黃素的調節作用。方法 采用5%?；悄懰徕c逆行膽胰管注入制作大鼠急性重癥胰腺炎模型。將SD雄性大鼠隨機分成假手術組、模型組、大黃素組，大黃素組于造模后每日予大黃素20 mg/kg灌胃，模型組及假手術組予等量生理鹽水灌胃。造模后每日觀察大鼠精神狀態、厚膩苔出現情況及存活率；造模第5日后各組隨機選取8只大鼠處死，留取標本，采用Western blot和實時定量PCR檢測舌組織AQP3蛋白及基因表達。結果 與模型組比較，大黃素組大鼠死亡率、厚膩苔發生率降低及厚膩苔發生明顯減少，AQP3蛋白及基因表達明顯降低（P<0.05）。至實驗第5日，模型組存活11只大鼠，出現厚膩苔5只；與假手術組比較，模型組大鼠舌組織AQP3蛋白及基因表達均明顯升高（P<0.05）。結論 大黃素通過下調AQP3蛋白及基因表達，改善重癥急性胰腺炎大鼠癥狀，減少厚膩苔的發生。

關鍵詞：胰腺炎；大黃素；水通道蛋白3；基因表達；蛋白表達；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0069-04

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP）是臨床常見危重病之一。臨床觀察發現，近半數表現為肝脾濕熱證[1]。前期研究表明，SAP大鼠在病情發展過程中可部分出現舌苔厚膩的“濕”象，血管通透性增高能促進厚膩苔的發生[2]。水通道蛋白3（AQP3）是與水及甘油等小分子通透性有關的轉運蛋白，廣泛表達于消化道上皮細胞，研究表明，AQP3異常表達可引起黏膜通透性的改變[3-4]。本研究觀察大黃素干預治療對SAP大鼠厚膩苔及舌組織AQP3表達的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±50）g，解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK（軍） 2007-0004。

1.2 藥物、試劑與儀器

大黃素，昆明風山漸醫藥研究有限公司；?；悄懰徕c，美國Amresco公司；兔抗AQP3多克隆抗體 （1∶1000），英國Abcam公司，β肌動蛋白（β-actin， 1∶1000）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗 （1∶3000），美國Santa Cruz公司。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（SUNBIO），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），cDNA反轉錄試劑盒（Applied Biosystems，美國）。Smartspec plus核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司），RT-PCR system（美國ABI公司），高速低溫離心機Sigma 3K-18（美國Sigma公司），紫外分光光度計U-2001 UV/VIS（日本東芝），凝膠成像儀及Icycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組、造模與給藥

入選大鼠共45只，隨機分為模型組（20只）、大黃素組（15只）、假手術組（10只）。采用胰膽管逆行勻速注入?；悄懰徕c（1 mL/kg）的方法制備大鼠SAP模型[5]。大黃素組于術后即予灌胃，每次10 mg/kg，模型組和假手術組予等量生理鹽水灌胃。2次/d，連續4 d。

1.4 標本制備

造模后第5日，每組隨機選取8只大鼠，麻醉后心臟取血，留取舌組織（舌中部接近中線位置），分別以多聚甲醛水溶液固定，液氮保存備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般觀察 造模后每日觀察大鼠精神狀態、舌質、舌苔等證象，并記錄死亡情況。

1.5.2 舌組織水通道蛋白3蛋白表達檢測 采用Western blot檢測舌組織AQP3蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書步驟操作，根據標準曲線計算出蛋白濃度。一抗及二抗孵育后DAB顯色、ECL曝光，并用LabWorks軟件對圖像進行灰度分析。

1.5.3 大鼠舌組織水通道蛋白3基因表達檢測 采用RT-PCR檢測舌組織中AQP3基因表達。Trizol試劑提取各組舌組織總RNA，并以紫外吸收法定量。隨后，cDNA反轉錄按試劑盒說明書步驟操作。引物由北京賽百盛公司設計：AQP3（上游5'-ACCTCCATGGGCTTC AATTCT-3'，下游5'-AGTGAAAAGGCGAGGTCCAA-3）；GAPDH（上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'，下游5'-CTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'）。反應體系為20 μL，內參照基因為大鼠GAPDH。采用相對定量2-ΔΔCt值方法分析。設定標準對照品基因表達為1。

1.6 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析及q檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌苔的影響

模型組：術后大鼠現倦怠，聳毛，部分大鼠出現便溏，至第5日存活11只大鼠中出現厚（黃或白）膩苔5只。大黃素組：大鼠麻醉蘇醒后活動略減少，至次日活動、飲食均明顯好轉，倦怠逐漸減輕，大便呈黃稀便，至第5日，大鼠共存活12只，僅2只大鼠出現厚（黃或白）膩苔，顯著低于模型組。表明大黃素可明顯減少SAP大鼠厚膩苔的發生。假手術組：大鼠麻醉蘇醒后活動略減少，次日開始即飲食、活動基本正常，無倦怠、聳毛，大便正常，未現便溏；舌苔與正常大鼠比較無明顯變化。

2.2 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠存活率的影響

至實驗第5日，模型組大鼠存活11只（存活率為55%），大黃素組大鼠存活12只（存活率為80%），存活率明顯高于模型組，見圖1。提示大黃素可明顯改善SAP大鼠預后。

2.3 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3蛋白表達的影響

模型組大鼠舌組織中AQP3蛋白表達明顯高于假手術組（P<0.05）；與模型組比較，大黃素組AQP3蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖2。

2.4 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3基因表達的影響

與假手術組比較，模型組和大黃素組大鼠舌組織中AQP3 mRNA明顯升高（P<0.05），但2組比較差異無統計學意義。見圖3。

3 討論

中醫學認為，急性胰腺炎與肝、膽、脾、胃、大腸等臟腑密切相關，由于飲食不節、恣食膏粱厚味、情志不暢、蛔蟲竄擾等致肝膽脾胃功能失職，濕、熱、毒、瘀蘊結中焦，氣機升降失調而致病。唐氏等[1]觀察臨床51例急性胰腺炎患者，其中17例表現為肝脾濕熱型，舌苔厚膩。而本實驗也發現SAP大鼠造模第5日厚膩苔的出現率明顯增多。

大黃素是從大黃中提純的蒽醌類衍生物，現代研究表明，大黃素具有抑酶、抑菌、導瀉、解除括約肌痙攣作用等[6-8]。我們前期研究發現，大黃素能明顯改善SAP大鼠胰腺病理破壞，降低血淀粉酶水平，改善預后[9]。本研究顯示，大黃素可降低SAP大鼠死亡率，對SAP的治療作用與前期研究及相關文獻報道一致[8，10]。

現代研究表明，濕熱證病理生理中，水濕停滯、潴溜于體內是主要的臨床改變之一。脾胃濕熱證大鼠模型可見，濕偏重者脾臟血竇周圍內皮細胞明顯水腫；溫病濕熱證濕重于熱動物模型舌固有層水腫明顯[11]。由此可見，水液代謝失衡在濕熱證的病理生理過程中起著重要的作用。鑒于膩苔是濕證的特征性舌苔，提示膩苔的形成與水濕停滯、潴留于體內可能有關。

AQPs是細胞膜上的一種與水的通透性有關的轉運蛋白。已有研究顯示，脾胃濕熱證患者胃黏膜AQP3、AQP4基因和蛋白表達水平顯著高于正常對照組，中藥清熱化濕方可顯著降低二者的蛋白和基因表達水平[12]。本研究通過Western blot、實時定量PCR分析發現，SAP大鼠舌組織中AQP3蛋白及基因表達均明顯升高。鑒于AQP3是一種小分子物質通透性相關的轉運蛋白，其水平升高可增加小分子物質的通透，引起水濕停滯，故推測AQP3與SAP大鼠濕證的發生及厚膩苔形成可能有關。

大黃能促進胃腸蠕動，防治麻痹性腸梗阻，促進腸道內毒素排泄，保持腸道微生態平衡，并且能降低腸黏膜通透性，抑制腸道細菌及內毒素移位等作用。我們的前期研究結果提示，AQP3參與了SAP的病理生理改變，考慮為腸黏膜通透性增高的機制之一[10]；大黃素治療使AQP3蛋白及基因表達下降，可能與大黃素治療SAP時降低腸黏膜通透性有關。本研究結果發現，大黃素可明顯下調SAP大鼠舌組織AQP3的蛋白及基因表達，同時，大黃素治療后厚膩苔的發生也明顯減少，其機制可能是通過下調AQP3蛋白及基因表達，減少水的通透性，還有待進一步探討。

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（收稿日期：2014-10-10；編輯：華強）