雷林潔　楊淼　霍潘峰　王軍　馬亮英

【摘 要】 目的：建立小兒腹瀉散中沒食子酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Inert Sustain C18柱（250×4.6mm，5μm）；檢測波長：271nm；流速：1.0ml·min-1；柱溫：40℃；流動相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）。結果：沒食子酸在1.55～62μg·ml-1范圍內呈良好的線性關系，r=0.9999，平均回收率為99.24%，RSD=0.64%。小兒腹瀉散中沒食子酸的含量為5.18mg·g-1，RSD=1.66%。結論：該方法操作簡單、準確，可用于小兒腹瀉散中沒食子酸的含量測定及質量控制。

【關鍵詞】 HPLC；小兒腹瀉散；沒食子酸；含量測定

【中圖分類號】R917 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）13-0004-02

小兒腹瀉散為我院的醫(yī)院制劑（制劑批準文號：新藥制字Z20040551），全方由兒茶、五倍子、清半夏、朱砂、枯礬、氫氯噻嗪等藥組成，已臨床使用多年，具有澀腸止瀉的功效，主要用于小兒“水樣便”腹瀉。處方中除兒茶具有收斂止瀉的作用外，五倍子中的鞣質也是其止瀉的主要化學成分。多年來，鞣質成分在醫(yī)藥領域被公認為具有較強的收斂性及蛋白質凝固作用，臨床上用于各種止血、止瀉及抗菌抗病毒[2]。隨著新技術、新方法的應用，還發(fā)現(xiàn)鞣質具有抗脂質過氧化、抗突變、清除自由基、抗艾滋病與抗腫瘤等多種藥理活性[3]，使其在臨床中日益受到重視，也對沒食子酸的含量測定方法提出了更高的要求。中國藥典記載五倍子中鞣質的含量以沒食子酸[1]計不低于50%。本文參照中國藥典，采用高效液相色譜法測定小兒腹瀉散中沒食子酸的含量，提高小兒腹瀉散的質量標準，為更好地控制該制劑的質量提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-M20型檢測器、 CTO-20ASVP型柱溫箱、SIL-20A自動進樣器，日本島津）；電子天平（BS210S，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1mg）；恒溫水浴鍋（DK-S26型，上海精宏實驗設備有限公司）；高速中藥粉碎機（HX-200型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；超聲波清洗器（KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；智能恒溫電熱套（DRT-SX型，鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 材料 沒食子酸對照品（批號：110831-201204，中國食品藥品檢定研究院）；小兒腹瀉散（批號：20141224、20141226、20141228，新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院）；甲醇（sigma，色譜純）；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inert Sustain C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）；流速：1.0 ml·min-1；進樣量：10μl；柱溫：40℃，由對照品色譜（液相檢測器為二極管陣列）確定檢測波長為271nm。理論板數按沒食子酸峰計算應不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品6.2mg，置100ml棕色量瓶中，采用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得62μg·ml-1沒食子酸對照品儲備液。

2.3 供試品溶液制備[1] 精密稱取小兒腹瀉散0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25ml，稱定重量，超聲處理5min，冷卻，再次稱量重量，采用50%甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察 精密量取沒食子酸對照品溶液（沒食子酸濃度為62μg·ml-1）0.2、0.5、1、3、5、10ml分別置10ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。沒食子酸的線性回歸方程為y=29474x+4186.7，相關系數r=0.9999，表明沒食子酸在1.24～62μg·ml-1范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取濃度為12.4μg·ml-1的同一對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，進樣量10μl，結果峰面積平均值為368037.8，RSD為0.49%，試驗結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后1、2、3、6、9、12h進樣，記錄色譜圖，結果沒食子酸的平均峰面積為367542.8，RSD為0.15%，試驗結果表明供試品溶液在12h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 分別精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl進樣，供試品中沒食子酸平均含量為5.26mg·g-1，RSD為0.98%，結果表明沒食子酸含量測定方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品9份，分別精密加入高、中、低濃度對照品溶液各3份，按供試品溶液的制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表1。平均回收率為99.24%，RSD=0.64%。

2.9 樣品含量測定 照供試品溶液的制備方法分別制備3個批次的供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μl進樣，記錄峰面積，計算沒食子酸含量，結果3批樣品中沒食子酸平均含量為5.18mg·g-1，RSD為1.66%。

3 討論

3.1 供試品處理 [4-6] 供試品溶劑的選擇，分別采用無水乙醇、60%乙醇、甲醇、50%甲醇、純水對樣品進行超聲提取，結合液相色譜系統(tǒng)適用性的考察，確定采用50%甲醇作為提取溶劑提取效果最佳，色譜峰能夠較好的分離，而含乙醇的溶劑提取出的樣品色譜峰不能分離，無法計算峰面積。超聲提取時間的考察分別考察了5、10、15、30min，沒食子酸的含量無顯著性差異。因此，供試品的制備選用50%甲醇超聲提取5min。

3.2 流動相的選擇[7-10] 實驗考察了不同比例甲醇-磷酸溶液、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液作為流動相，均能得到較好的色譜峰。其中當甲醇-0.085%磷酸溶液（15∶85）時，出峰時間較快，但色譜峰分離度不夠。經預實驗篩選，結合節(jié)約成本和保護色譜柱的考慮，確定采用甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）作為流動相。

小兒腹瀉散作為我院特色制劑，療效顯著，但處方成分復雜，不僅由中西藥組合，還含有毒性藥材朱砂，因此在臨床使用與制劑質量控制過程中應該嚴格控制，加強臨床監(jiān)管，提高制劑質量標準，保障患兒的生命健康。本文結合制劑的特點，參照中國藥典中五倍子的含量測定方法，建立了小兒腹瀉散中沒食子酸的HPLC含量測定方法，該方法簡單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于小兒腹瀉散的質量控制。

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（收稿日期：2015.03.23）