金華地區規模豬場豬鏈球菌2型的分離鑒定及特性研究

張超穎，蔣小武，沈紅霞，楊云凱，章紅兵，方維煥

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州310029;2.金華職業技術學院)

豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是引起斷奶仔豬死亡的重要原因之一，且可導致不同年齡段豬的多種疾病，如敗血癥、多發性關節炎、急性腦膜炎等［1］。該病原廣泛分布于世界各地規?；B豬地區，根據其莢膜抗原的不同可分為35 種血清型(血清型1－ 34 和血清型1/2)，其中豬鏈球菌2 型(SS2)流行最為廣泛，是一種重要的人畜共患病病原［2－3］。隨著我國豬場規?；B殖程度的不斷提高，作為規模豬場三大疫病之一的豬鏈球菌病已經引起人們的重視。

為了解金華地區規模豬場健康豬群攜帶豬鏈球菌的現狀，本研究隨機采集了4 個規模豬場不同年齡段臨床健康豬的鼻拭子樣品，進行豬鏈球菌的分離鑒定和生物學特性研究，旨在為該地區豬鏈球菌病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 SS2 參考強毒株HA9801，由南京農業大學陸承平教授饋贈。

1.2 試劑及器材 試驗所用培養基;選擇性THB培養基、鮮血瓊脂平板培養基等購自青島某生物有限公司。慶大霉素等34 種常用抗生素藥敏試紙片，購自杭州某生物試劑有限公司;細菌微量生化反應管，購自杭州某微生物試劑有限公司，批號20131120;Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 等購自大連某公司，PCR 引物合成于深圳某公司。試驗器材主要包括PCR 儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀、酶標儀(Thermo 公司)等。

1.3 試驗動物 6 周齡雌性BALB/C 小鼠購自上海某公司。

1.4 樣品采集 金華地區4 個規模豬場不同年齡、臨床表現健康豬(分為哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和母豬)采集鼻拭子320份，用滅菌棉簽伸入豬只鼻腔較深處刮取黏膜表面，立即投入裝有5 mL THB液培養基的無菌具蓋試管中，低溫保存，2 h 內送回微生物實驗室進行分離培養。

1.5 細菌分離培養及形態觀察 將各豬場采集的樣品于37℃增菌培養24h 后，無菌操作，用接種環挑取樣品劃線接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養24 h。挑取乳白色、半透明、直徑1 ～2 mm 的圓形疑似菌落，鏡檢后接種于鮮血瓊脂平板進行純培養，觀察細菌生長情況。挑取純培養物進行革蘭氏染色、鏡檢及其他生物學特性試驗。

1.6 生化鑒定 挑取純培養物按常規方法進行生化試驗［4］，觀察并記錄結果。

1.7 血清型鑒定 參考文獻合成引物GDH 與cps2J，進行雙重PCR 擴增鑒定SS2［5］，其中GDH 大小為688 bp，cps2J 大小為457 bp。

1.8 致病力試驗 分別將金華SS2 分離株與HA9801(陽性對照)于37℃振蕩培養至OD600≈0.3－0.4，離心收集菌體，PBS 清洗，調整細菌濃度約為5 ×108CFU/mL(當量于HA9801 的LD50)，并進行10 倍連續稀釋，平板計數以確定實際接種量［6］。腹腔注射于6 周齡雌性BALB/C 小鼠，1 mL/只，每組6 只，陰性對照組注射滅菌PBS。注射后各組分別飼養，給予充足飲水和飼料，定時觀察記錄小鼠的發病和死亡情況，連續觀察7 d。

1.9 藥敏試驗 用K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗［7］，用滅菌棉簽將菌液均勻涂布于鮮血瓊脂培養基表面，至菌液稍干后，將不同藥敏試紙片貼于培養基的適當位置。37℃培養24 h，觀察并測定抑菌圈大小，進行耐藥性分析。

2 結果與分析

2.1 細菌培養特性及形態特點 經測定，分離到的細菌在鮮血瓊脂平板上生長良好，菌落呈圓形半透明、灰白色、似針尖大小，有溶血現象，多數為α 溶血，部分呈β 溶血。細菌純培養物涂片、革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下可見革蘭氏陽性、呈短鏈狀的藍紫色球菌，生化試驗符合豬鏈球菌特性［4］。

2.2 血清型鑒定 分離SS 疑似菌株4 株，其中SS2 型菌2 株。4 株疑似豬鏈球菌菌株雙重PCR 鑒定判定:GDH 陽性即為豬鏈球菌，GDH 與cps2J 雙陽性則為豬鏈球菌2 型(圖1)。

圖1 4 株疑似豬鏈球菌菌株的PCR 鑒定

2.3 致病力測定 接種不同SS2 菌株后，觀察1 周統計接種劑量及小鼠死亡數(詳見表1與圖2)。

表1 豬鏈球菌2 型分離株感染小鼠死亡率

圖2 豬鏈球菌2 型分離株感染小鼠死亡曲線

由表2、圖1可見，2 株分離菌SS2-324 與SS2-325 對小鼠具有一定致病力，但與參考強毒株HA9801 相比，致病力較弱，且小鼠死亡時間延后。

2.4 藥敏試驗結果 見表2。

表2 兩株豬鏈球菌2 型分離株對不同抗菌素的敏感性測定(紙片法)

由表2可見，采用34 種不同類型的抗菌素進行藥敏試驗測定抑菌圈大小，判定不同菌株藥物敏感程度，其中2 株豬鏈球菌2 型菌株對氯霉素、氧氟沙星等大部分藥物敏感，對慶大霉素、卡那霉素等藥物出現不同程度耐藥，對四環素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素完全耐藥。

3 小結與討論

鏈球菌廣泛分布于自然界，有多種血清型，主要存在于動物鼻咽部、皮膚、消化道粘膜，經消化道和呼吸道感染。

本研究旨在對金華地區規模化豬場豬鏈球菌病進行流行病學調查，通過對疑似發病豬進行臨床診斷、病理剖檢、病料采集及鼻拭子采樣等手段進行豬鏈球菌病調查。

通過采集4 個規模豬場不同年齡段健康豬群的鼻拭子樣品，雖在疑似臨床病例的病料中未分離到豬鏈球菌，但在4 個豬場的鼻拭子樣品中分離到了4 株豬鏈球菌，經PCR 方法進行血清型鑒定發現其中有2 株為豬鏈球菌2 型。且4 株病菌均來自同一豬場，表明該豬場可能存在豬鏈球菌2 型的隱性感染，一旦感染其他疫病，則可能出現臨床癥狀。

通過對2 株豬鏈球菌2 型分離株的藥敏試驗結果顯示，對臨床常用的5 種抗菌藥物(四環素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素)已產生完全耐藥，提示可能與養殖場長期使用該類抗菌藥物等因素有關，應引起注意和重視。

［1］Wertheim HF，Nghia HD，Taylor W，＆ Schultsz C.Streptococcus suis:an emerging human pathogen［J］.Clinical infectious diseases:an official publication of the Infectious Diseases Society of America，2009，48(5):617－625.

［2］Feng Y，et al.Streptococcus suis infection:an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases［J］.Virulence，2014，5(4):477－497.

［3］Wei Z，et al.Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007［J］.Veterinary microbiology，2009，137 (1－ 2):196－201.

［4］陸承平，獸醫微生物學(第四版)［M］.北京:中國農業出版社，2007.8.

［5］Tang Y，et al.Genetic and virulence characterization of Streptococcus suis type 2 isolates from swine in the provinces of Zhejiang and Henan，China［J］.Folia microbiologica，2011，56(6):541－548.

［6］Tao Chen QH，Zhaolong Li，Wei Zhang，Chengping Lu，Huochun Yao.Construction and Characterization of a Streptococcus suis Serotype 2 Recombinant Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein［J］.PloS one，2012，7(7):10.

［7］姚火春.獸醫微生物學實驗指導［M］.北京:中國農業出版社，2002.2.