24例TRFIA法檢測抗—HIV抗體初篩實驗灰區帶結果的分析

摘要：目的 我室自使用時間分辨熒光免疫（TRFIA）法檢測抗-HIV抗體后，頻繁出現位于灰區帶的檢測結果，為明確該方法的方法可靠性及其高靈敏度的必要性。方法 通過對我室2013年5月～2014年5月的45378例血清樣本進行TRFIA法檢測抗-HIV初篩試驗，檢測結果發現有24例結果處于灰帶區的血清樣本，將這24例樣本用酶聯免疫（ELISA）法和膠體金法復查，并送攀枝花市疾控中心，用蛋白印記（WB）法做確證實驗。結果 TRFIA法檢測出的24例灰區樣本經ELISA和膠體金兩種方法復查結果均是陰性，攀枝花市疾控中心用WB法做確證實驗，反饋結果顯示24例灰區樣本中1例陽性，5例不確定，18例陰性。結論 TRFIA法有較高的靈敏度，雖然由于靈敏度的提高造成假陽性率升高，但是有效避免了漏診，起到縮短窗口期的作用，適合HIV初篩實驗室使用。

關鍵詞：抗-HIV；抗體；TRFIA法；ELISA法；膠體金法；灰區帶

近年來，我室HIV感染率呈明顯上升趨勢，為縮短窗口期，實現HIV早診斷，早治療，更好地預防和控制HIV傳播，我室于2012年將HIV初篩檢測方法由ELISA法改換成TRFIA法[1]。我們發現該方法的檢測結果處于灰區帶的樣本明顯增多。為明確這些灰區結果是否是假陽性，筆者對2013年5月～2014年5月的45378例臨床血清樣本進行TRFIA法抗-HIV初篩檢測，檢測結果發現24例處于灰區的血清樣本，將這24例樣本用ELISA法和膠體金法復查，并送攀枝花市疾控中心，用蛋白印記法做確證實驗，結果報告如下

1資料與方法

1.1一般資料 來自我室2013年5月～2014年5月的臨床血清樣本共45378份。

1.2試劑

1.2.1蘇州新波生物技術有限公司 人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體檢測試劑盒（雙抗原夾心時間分辨熒光分析法）

1.2.2北京萬泰生物藥業股份有限公司 人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）

1.2.3英科新創（廈門）科技有限公司 人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒（膠體金法）

1.3儀器時間分辨熒光分析儀洗板機等

1.4方法

1.4.1TRFIA法 將45378份標本用時間分辨熒光分析法檢測：①將標本離心分離出血清，配制工作洗液和復溶標記物。②分別在相應微孔中加入陰、陽性對照及待測樣品100μL。③室溫振蕩60min。④配制HIV抗原-EU3+工作液（第三步溫育前1h之內配制）。⑤用工作洗液洗滌微孔板5遍，扣干。⑥每孔加入HIV抗原-EU3+工作液100μL。⑦室溫振動40min。⑧用工作洗液洗板5遍，扣干。⑨每孔加入100μL增強液，振蕩5min，選擇相應程序檢測。

1.4.2ELISA法 將TRFIA法檢出的24例灰區樣本進行ELISA法檢測：①配制工作洗液。②分別在相應孔中加入待測樣品及陰性、陽性對照100μL。③用封板膜封板后，置37℃溫育60min。④小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。⑤每孔加入酶標試劑100μL。⑥用封板膜封板后，置37℃溫育30min。⑦操作同步驟4。⑧每孔加入顯色劑A、B液各50μL，混勻，37℃顯色30min。⑨每孔加終止液50μL，混勻，10min內測定結果。設定雙波長450nm/630nm。

1.4.3膠體金法 將TRFIA法檢出的24例灰區樣本進行膠體金法檢測：①取60μL血清樣本滴加于加樣處。②在1～30min之內判讀結果。

1.4.4 WB法 把24例樣本送攀枝花市疾控中心做WB法確證實驗。

2結果

2.1TRFIA法結果判讀

2.1.1臨界值計算 陰性對照平均熒光強度記為NCx，陽性對照平均熒光強度記為PCx，Cutoff=PCx×0.03+NCx。

2.1.2若S/CO<1，判為HIV抗體陰性；若S/CO≥1，判為HIV抗體陽性。

2.1.3實驗室室內質控的S=0.234，灰區范圍設置為1±0.468。

2.2 ELISA法結果判斷

2.2.1臨界值計算：臨界值=陰性對照孔A均值+0.12。

2.2.2樣品A值<臨界值者為HIV抗體陰性，樣品A值>臨界值者為HIV抗體陽性。

2.3膠體金法結果判斷 檢測區和對照區各出現一條紫紅色色帶，則判為陽性；若檢測區無色帶，對照區出現一條色帶，則判為陰性；若對照區未出現色帶，則檢測無效。

2.4 24例灰區標本用4種方法檢測結果，見表1。

3討論

TRFIA法是近年來使用廣泛的一種檢測技術，其原理是利用三價稀土金屬銪作為標記物，抗原抗體反應完成后通過時間分辨熒光分析儀檢測標記物的熒光強度來對待測抗體進行定量分析。與ELISA等定性方法相比，TRFIA定量測定除了能檢測出低濃度陽性指標外，還能給臨床一個量化的指標，使結果更直觀。從上文比較可以看出24例灰區標本最終確證實驗1例陽性，5例不確定，這六例標本ELISA法和膠體金法均是陰性。HIV的窗口期較長，初篩實驗應更加強調方法的靈敏度，以便篩查出處于感染早期的抗體滴度較低的HIV感染者，縮短窗口期，以達到早發現，早治療，控制流行和傳播的目的。而對于其他確證結果為陰性的灰區結果，造成假陽性的原因可能是非特異性的熒光干擾，例如空氣灰塵中或水質中存在的熒光物質干擾，另外一些疾病特別是自身免疫性疾病也可能是假陽性產生的原因[2，3]。

參考文獻：

[1]文進，張斌.ELISA法對抗-HIV灰區標本的再檢測分析[J].臨床輸血與檢驗，2005，4（7）.

[2]楊彩霞，傅繼華，畢振強，等.HIV-1感染者免疫學及血清學指標檢測[J].中國公共衛生，2008，24（6）：695-696.

[3]阮樂幸，袁國平，謝芳.抗-HIV假陽性結果分析[J].現代預防醫學，2005，32（12）：1763.

[4]中國疾病控制中心.全國艾滋病檢測技術規范[S]（2009年修訂版），2010，10，05.

編輯/孫杰