順鉑誘導三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型的建立

盛佳鈺，陳紅風

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院乳腺科，上海 200032）

研究報告

順鉑誘導三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型的建立

盛佳鈺，陳紅風*

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院乳腺科，上海 200032）

目的建立一種耐藥性穩定的三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型，為研究體內腫瘤耐藥機制和逆轉藥物的篩選奠定實驗基礎。方法采用順鉑（DDP）低劑量誘導及體內外交叉致瘤結合的方法建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型；MTT法檢測細胞耐藥特性；實時熒光定量PCR法分析耐藥相關基因MDR1、BCRP、MMP7及GST-π表達差異；免疫組化分析耐藥相關蛋白P-gp、BCRP、MMP7表達差異；蛋白印跡法檢測磷酸化Akt（phosphorate-Akt，p-Akt）和總Akt（total-Akt，t-Akt）蛋白表達；小動物成像檢測觀察腫瘤生長情況。結果MTT顯示建立的三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型的耐藥指數為12.84；耐藥小鼠腫瘤組織中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA的表達量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表達量均高于非耐藥小鼠（P＜0.01）；Western blot顯示，耐藥小鼠腫瘤組織的p-Akt蛋白表達明顯高于非耐藥小鼠，t-Akt蛋白表達沒有差異。非耐藥小鼠與耐藥小鼠腫瘤組織生長速度未見明顯區別（P＞0.05）。分別給予這兩種模型小鼠相同劑量的DDP治療后，耐藥小鼠對DDP的敏感性明顯低于非耐藥小鼠（P＜0.01）。結論初步建立了三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型，為三陰性乳腺癌臨床個體化治療及耐藥逆轉研究等提供了良好的實驗動物平臺。

三陰性乳腺癌；腫瘤抗藥性；順鉑；動物模型；小鼠

目前認為乳腺癌是一種高度異質性腫瘤，不同的病理特點和分子特征導致其對治療的反應和預后明顯不同。臨床上根據免疫組化檢測的雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達均陰性者被稱為三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。該亞型乳腺癌對內分泌治療及抗HER-2的靶向治療均不敏感，因此化療是其主要的治療手段。近年來研究發現，TNBC這類與乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene-1，BRCA1）相關的乳腺癌亞型對鉑類藥物表現出較高的敏感性［1］。然而，事實證明對化療相對敏感的TNBC患者并不意味著擁有更高的生存率。與其他化療藥物一樣，在臨床應用過程中多數患者經鉑類藥物化療緩解后，即會產生耐藥性而使后續治療效果受到嚴重影響。本實驗以順鉑（cisplatin，DDP）為誘導藥物，三陰性乳腺癌細胞株4T1為誘導對象，采用化療藥物誘導耐藥及體內外交叉致瘤的方式建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型，并對三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型產生順鉑耐藥性的機制進行初步探討，為耐藥逆轉研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

注射用順鉑（凍干粉）購自齊魯制藥有限公司（批號：ZWA2A1305034A），RPMI-1640液體培養液、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均為Gibco公司產品；四甲基氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均購自上海生工生物有限公司。TRIZOL提取試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；實時熒光定量PCR所用引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成；抗磷酸化 Akt（phosphorate-Akt，p-Akt）、總 Akt（total-Akt，t-Akt）、內參GAPDH（均為抗兔單克隆抗體）及其相應的二抗均購自美國Cell Signaling公司；P-gp、BCRP、MMP7抗體均購自美國ABCAM公司；EliVision plus試劑盒、DAB試劑盒均購自福州邁新生物科技有限公司，D-luciferin購自上海樂辰生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及動物飼養

鼠三陰性乳腺癌細胞株4T1購自中國科學院上海細胞庫，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養，培養基中加入100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素。置于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養，次日觀察細胞貼壁情況并換液。貼壁生長良好的乳腺癌細胞經0.25%胰蛋白酶消化，選用對數生長期細胞進行實驗。

SPF級BALB/c雌性小鼠56只，體重16～18 g，其中24只小鼠用于耐藥動物模型的建立（每輪6只，共4輪），余32只小鼠用于后續分組研究。小鼠均來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2012-0002］，適應性喂養1周，飼養在恒溫（23±2）℃，濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h的飼養室內，標準飼料和自來水自行取用。

1.3 模型的建立

采用化療藥物誘導耐藥及體內外交叉致瘤的方式建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型。將4T1細胞體外培養至對數生長期后按105個/只，接種于6只小鼠的第二乳房墊處，隨機均分為2組。待腫瘤組織長至0.5 cm×0.5 cm時（約5 d），模型組（3只）荷瘤小鼠給予腹腔注射0.3 mg/mL DDP，對照組（3只）小鼠給予同等劑量的NS腹腔注射。每周1次，連續4周，給藥結束后，在無菌條件下取出各組腫瘤組織，行原代細胞培養。將組織塊置于培養皿內，剪碎成米粒樣大小，用胰酶反復消化瘤塊，將消化下來的腫瘤細胞，按4T1細胞培養條件進行培養。各組原代培養細胞經穩定傳代2次后，再接種于小鼠第二乳房墊，每次原代培養細胞均用采用MTT的方法計算耐藥倍數。反復4輪體內外交叉致瘤，至耐藥倍數達到中度耐藥時（耐藥倍數5～15倍）為止。最后一輪小鼠給藥結束后，2組小鼠各取部分腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液及ˉ80℃冰箱保存用于免疫組化、real-time PCR及western blot檢測；剩余腫瘤組織分別行原代細胞培養。

取上述第4輪達中度耐藥的原代培養4T1/ DDP細胞，培養至對數生長期，接種于6孔板中，繼續培養24 h，當細胞達到70%～80%融合時，進行轉染。轉染按照Lipofectamine TM 2000試劑操作指南進行操作。轉染48 h后，G418篩選抗性細胞及其單克隆化，得到穩定表達熒光素酶的4T1/DDP-luc細胞。取對數生長期的4T1/DDP-luc細胞接種到96孔黑板中，常規培養24 h。第2天采用活體成像儀進行luc發光信號的觀察，檢測luc的表達，用Living Imaging軟件分析處理數據。

取32只小鼠，將上述經鑒定能穩定表達Luc質粒的耐藥細胞株4T1/DDP-luc及非耐藥細胞株4T1-luc體外培養至對數生長期后，按105個/只，分別接種于4組小鼠的第二乳房墊處，分別建立三陰性乳腺癌耐藥及非耐藥小鼠模型各16只。待各小鼠腫瘤組織均長至0.5 cm×0.5 cm時（約5 d），16只三陰性乳腺癌小鼠模型隨機分組為：Model-A組及DDP-A組，每組各8只小鼠；16只三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型隨機分組為：Model-B組、DDP-B組，每組各8只小鼠。各組小鼠均按0.2 mL/20 g劑量腹腔注射相應藥物，給藥頻次為，給藥周期為4周，具體給藥為：DDP-A及DDP-B組小鼠給予0.3 mg/mL DDP；模型組-A及模型組-B組小鼠給予0.9%生理鹽水。

1.4 M TT法檢測細胞藥物敏感

分別取對數生長期原代培養4T1細胞（Control組）和4批原代培養的4T1/DDP細胞（Model-1、2、3、4組），調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔培養板中，每孔100μL。置37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養。培養24 h后，加藥組更換為含不同濃度藥物的完全培養液繼續培養。每組都設6個復孔，并設置調零孔（只含相應培養液，無細胞）和對照孔（只含細胞、培養液）。待藥物組作用24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）15μL，繼續培養4 h，小心吸棄培養液和MTT溶液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min使充分溶解顯色。用全波長酶標儀測定吸光度值（A490），實驗重復3次，取平均值，按下式計算細胞生長抑制率。

根據生長抑制率，采用SPSS16.0軟件計算藥物半數抑制濃度（IC50），并按下式計算耐藥倍數（RF）。

1.5 Real-time PCR檢測耐藥相關基因

采用TRIZOL法分別提取第4批耐藥模型Model-4組以及對照模型Control-4組小鼠腫瘤組織的總RNA，分光光度法測定其純度及濃度。用反轉錄試劑盒將各組細胞總RNA反轉錄，生成cDNA，進一步用MDR1、BCRP、MMP7、GST-π引物及內參GAPDH引物擴增（引物相關信息見表2）。Real-time PCR結果由Rotor-Gene 6軟件分析，確定各反應樣本的Ct值，采用相對定量的2ˉΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，分析各樣本之間基因的表達差異。每組取三個樣本，取均數。

表1 引物合成表Tab.1 List of primers for the real-time PCR

1.6 免疫組化法檢測耐藥相關蛋白

取出第4批耐藥模型（Model-4組）及對照模型（Control-4組）小鼠腫瘤組織經石蠟包埋，5μm切片，常規脫蠟至水，PBS洗3次，每次3 min；用pH 8.0 0.01 mol/L TE熱誘導修復（100℃，15 min），室溫自然冷卻，PBS洗3次，每次3 min；0.3%H2O2抑制內源性過氧化酶10 min；室溫，PBS洗3次，每次3 min；20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗，適當稀釋特異性一抗（P-gp、BCRP、MMP7抗體以1∶5000稀釋）37℃孵育2 h，PBS洗3次，每次3 min；EnVision試劑（HRP-M/R）37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色8～12 min；蘇木素襯染色，熱水藍化；吹干后，樹脂封片；鏡下觀察，核紫藍色，陽性呈棕黃色。每組隨機選取5張切片，在200倍視野下，每張切片隨機選擇陽性細胞表達明顯的3個視野作為測定目標。采用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，比較各組平均吸光度值。

1.7 W estern blot檢測Akt磷酸化相關蛋白

提取出第4批耐藥模型（Model-4組）及對照模型（Control-4組）小鼠腫瘤組織的蛋白，并定量樣本后，將等量的蛋白樣品（30μg）加入聚丙烯酰胺凝膠，常規電泳、轉膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉硝酸纖維素膜，室溫60 min，分別加入1∶8000稀釋的P-gp、MDR1及BCRP抗體及1∶5000稀釋的GAPDH（內參照）抗體。置于4℃搖床過夜，用含0.05%Tween 20的PBS（PBST）洗3次，每次5 min，加入1∶8000稀釋的二抗室溫培育1 h，TBST洗滌3次，加入化學底物發光液結合顯影、定影和掃描。用Photoshop Image J軟件分析各條帶灰度值。以目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值的比值表示目的條帶的相對表達量。

1.8 動物活體成像檢測

取材處理前1 d，所有4組小鼠均行活體成像檢測。具體方法如下：實驗前10 min將每組老鼠稱重，按0.2 mL/20 g體重的量腹腔注射D-luciferin試劑（PBS配比，最終使其濃度為15 mg/mL），用異氟烷將小鼠放人麻醉盒中麻醉，將小鼠安放于成像暗箱內，調整體位為仰臥位，當時間到達注射D-熒光素酶后的15 min，使用精諾真Xenogen IVIS成像向導完成圖像拍攝，應用Living Image 4.3（Lumina XR）軟件對小鼠體內區域信號進行數據分析。選擇反應單位弧度、單位體積、單位時間從體內發出的光子數的Radiance（photons）作為定量單位，即Radiance（p/s/cm2/sr），計算腫瘤灶數目。

1.9 統計學處理

所有實驗均平行重復3次，數據以xˉ±s表示。應用SPSS 16.0軟件，兩兩比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

將在無菌條件下取出各組腫瘤組織行原代細胞培養，約24 h后幾乎所有的細胞都沉積于瓶底，輕晃培養瓶約2/3的細胞隨培養液晃動，另1/3細胞貼壁。用PBS沖洗細胞后，顯微鏡下觀察可見，原代培養24 h后細胞呈三角形或多角形，并聚集生長成團塊；經1次傳代培養后，細胞分散程度較前改善，細胞形態趨于一致；經2次傳代培養后，貼壁細胞增殖迅速，形態均一，以多角形為主，胞體飽滿（見圖1）。

圖1 4T1/DDP細胞形態變化（×200）Fig.1 Morphology of 4T1/DDP cells（×200）

2.2 耐藥程度測定

MTT法檢測原代培養的4T1細胞（Control組）以及4批原代培養的4T1/DDP細胞（Model-1、2、3、4組）對DDP的IC50分別為和5.73、9.50、17.16、36.03μg/mL及 73.63μg/mL，4批原代培養的4T1/DDP細胞對DDP的RF分別為1.66、2.99、6.29及12.84，第4批原代培養的4T1/DDP細胞已達中等耐藥程度，可用以后續獲得性多藥耐藥小鼠模型建立（見圖2）。

2.3 鑒定4T1/DDP-luc細胞熒光素酶活性

將已獲得的穩定表達luc熒光素酶的4T1/DDP細胞置于96孔黑板中，加入底物D-luciferin并輕輕混勻后，運用活體成像系統對貼壁培養的細胞進行成像和圖像釆集。圖3（左圖）顯示，4T1/DDP-luc細胞于96孔黑板中檢測到的生物發光信號。體內檢測，將4T1/DDP-luc細胞接種于小鼠后1周，運用活體成像系統對小鼠進行圖像采集。圖3（右圖）顯示，接種了4T1/DDP-luc細胞的小鼠檢測到的生物發光信號。

2.4 耐藥相關基因表達

Real-time PCR檢測結果顯示，第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織中MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因mRNA的表達量均高于control組，差異有統計學意義（P＜0.01），分別是control-4組腫瘤組織的2.05倍、3.85倍、3.58倍及3.66倍（見圖4）。

圖2 順鉑對4T1和4T1/DDP細胞增殖的影響Fig.2 Effect of DDP on proliferation of the 4T1 and 4T1/DDP cells

圖3 熒光素酶活性鑒定Fig.3 Identification of the luciferase activity

2.5 耐藥相關蛋白表達

免疫組化檢測結果顯示，P-gp、BCRP、MMP7蛋白在第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織中均較強（棕黃色顆粒為陽性產物），分別為（4.34± 0.56）、（0.98±0.50）、（1.08±0.27）；而在Control-4組中表達均較低，分別為（14.93±1.18）、（10.95 ±1.62）、（15.66±1.11），差異均具有統計學意義（P＜0.01）（見圖5）。

2.6 Akt磷酸化相關蛋白表達

Western blot檢測結果顯示，在基礎狀態下第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織內磷酸化Akt（p-Akt）水平顯著高于control-4組，兩組t-Akt蛋白表達無明顯差異。上述western blot研究結果證實了三陰性乳腺癌獲得性多藥耐藥小鼠模型順鉑誘導三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型中存在著PI3K/Akt通路改變（見圖6）。

2.7 腫瘤動態觀察

第4周，通過活體成像系統對采集到的圖像進行分析，以radiance（photons）為計量單位，計算各組小鼠體內光子通量。如圖7，Mode-A組與Model-B組無明顯差異（P＞0.05）。與Model-A組相比，DDP-A組光子通量數減少（P＜0.01）；而與Model-B組相比，DDP-B組光子通量數無明顯差異（P＞0.05）。可見，DDP對耐藥模型小鼠腫瘤的抑制效果明顯低于非耐藥模型小鼠。

注：**為與control-4組比較差異有顯著性（P＜0.01）。圖4 MDR1、BCRP、MMP7和GST-π的基因在control-4和model-4組腫瘤組織的表達Note.**P＜0.01 compared with the control-4 group.Fig.4 ThemRNA expression of MDR1，BCRP，MMP7 and GST-πin the tumor tissues of control-4 and model-4 groups

圖5 Control-4和model-4組腫瘤組織中P-gp、BCRP和MMP7的蛋白表達（×200）Fig.5 The protein expression of P-gp，BCRP and MMP7 in the tumor tissues of control-4 and model-4 groups（×200）

圖6 Control-4和Model-4組腫瘤組織中p-Akt、t-Akt的蛋白表達Fig.6 The protein expression of p-Aktand t-Akt in the tumor tissues of control-4 and model-4 groups

3 討論

順氯氨鉑（cisplatin，DDP），簡稱順鉑，其抗瘤譜廣泛、活性高，且骨髓抑制等副作用較輕［2］。DDP的作用部位是DNA，它與DNA堿基產生鏈內及鏈間交叉連結，阻止DNA的轉錄和復制，從而抑制腫瘤細胞的分裂［3］。三陰性乳腺癌存在一定的DNA損傷修復障礙，因此該類型乳腺癌對鉑類藥物敏感性較高。DDP物美價廉，治療效果好，但應用中卻發現其容易產生耐藥性，部分患者先天和后天對鉑類藥物具有耐藥性［4］，嚴重降低該藥物的治療效果，使其抗腫瘤譜降低，限制了該藥物的臨床使用。

開發耐藥腫瘤模型對于耐藥相關基礎研究和藥物評價意義重大。當前國內外對耐藥機制的認識和逆轉劑的研究主要來自體外細胞實驗的研究成果，研究對象是體外誘導的耐藥細胞，并不能很好地反映體內腫瘤耐藥形成的情況。腫瘤動物模型水平的研究比腫瘤細胞培養水平的研究更能模擬人體內的腫瘤生長情況。目前常用的耐藥腫瘤的動物模型建立方法有三種：轉基因法［5］、耐藥性腫瘤細胞懸液移植法［6］及藥物誘導法［7］。

注：**為與model-A組比較差異及其顯著（P＜0.01）。圖7 小鼠體內光子通量數測定Note.**P＜0.01 compared with themodel-A group.Fig.7 Determination of the number of photons in vivo

但隨著研究的深入，我們發現藥物耐藥的形成機制眾多，主要包括外排蛋白的表達增加或活性提高、細胞解毒系統活力增強、抗腫瘤靶點改變以及凋亡應答失敏等。這些因素并非獨立存在，往往相互關聯，共同介導了耐藥的發生［8，9］。因此，類似轉基因法這種借助單一因素建立的多藥耐藥腫瘤動物模型難以模擬真實情況。而另兩種方法相比較，耐藥性腫瘤細胞懸液移植法簡單易行，在已有耐藥細胞株的前提下實驗周期短，應用較廣；而藥物誘導法則相對周期較長，但卻更能模擬臨床實際情況。目前，乳腺癌耐藥研究中應用較多的是激素受體陽性乳腺癌，針對三陰性乳腺癌的較少，且主要集中于阿霉素誘導耐藥，尚未有順鉑誘導的耐藥細胞模型。此外，由于耐藥細胞株構建時間較長，一般需要9～12個月，因此，本研究采用了藥物誘導法建立三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型，并在傳統的化療藥物單純誘導的基礎上進行了改進，增加了體內外交叉致瘤的方法。將體外培養的對數生長期的三陰性乳腺癌4T1細胞接種在小鼠第二乳房墊，形成腫瘤后，低劑量DDP體內持續給藥4周誘導耐藥發生，采用腫瘤組織塊行體外原代培養細胞，再將此原代培養細胞分別于新一批小鼠第二乳房墊接種致瘤；反復4次。采用此種體內外交叉進行致瘤的方法，逐步提高耐藥性，不僅模擬臨床耐藥形成條件，還提高了耐藥細胞的致瘤率和縮短致瘤時間，并在誘導過程中做到了對耐藥性的實時監測，且整個建模時間縮短為4個月。

經測定第4批原代培養4T1/DDP細胞對DDP的RF為12.84，已達中等耐藥程度。通過real-time PCR及免疫組化鑒定該耐藥細胞的特性，MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因及P-gp、BCRP、MMP7蛋白均顯示其在三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型的腫瘤組織中呈現高表達，而在非耐藥小鼠模型的腫瘤組織中均呈現陰性表達。此外，通過western blot檢測還發現，通過此種方法建立的三陰性乳腺癌獲得性多藥耐藥小鼠模型中存在著Akt磷酸化的改變。通過小動物活體成像儀對各組小鼠體內腫瘤生長狀態進行直觀觀測發現，經過4周生長非耐藥小鼠與耐藥小鼠腫瘤組織大小未見明顯區別（P＞0.05）。而給予這兩種模型小鼠相同劑量的DDP治療后，耐藥小鼠對DDP的敏感性明顯低于非耐藥小鼠（P＜0.01），提示接種了4T1/DDP-luc細胞的模型小鼠體內發生了耐藥。良好的耐藥模型的建立是進行下游實驗的基礎，該耐藥動物模型的建立，為三陰性乳腺癌臨床個體化治療及耐藥逆轉研究等提供了良好的實驗動物平臺。

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Fstablishment of a cisplatin-resistantmousemodel of 4T1 triple negative breast cancer

SHENG Jia-yu，CHEN Hong-feng*
（Department of Breast Surgery，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200032，China）

【Abstract】ObjectiveTo establish a cisplatin-resistant4T1 mousemodel of triple negative breast cancer.M ethodsA drug resistantmice model was established with cisplatin（DDP）induction and in-vivo/in-vitro tumorigenic approach.Its resistance characteristics were identified by MTT assay.Changes of drug resistance gene（MDR1，BCRP，MMP7，GST-π）and protein（P-gp，BCRP，MMP7）expression，and phosphorate-Akt and total-Akt protein expression were evaluated by real-time PCR，immunohistochemistry and western blotmethod，respectively.Small animal live imaging technology was applied to detect tumor growth.ResultsResistance fold（RF）of cisplatin-resistant4T1 mousemodelwas 12.84.The expression of MDR1，BCRP，MMP 7，GST-πmRNA and P-gp，BCRP，MMP 7 proteins in the resistantmice were higher than that in the non-resistantmice.The result ofwestern blot showed that a statistically higher expression of p-Akt in resistantmice than that in non-resistantmice at protein levels（P＜0.01）.No significant difference of tumor growth rate was observed between non-resistant and resistantmice（P＞0.05）.Given same dose of DDP，resistantmice showed lower sensitivity than non-resistantmice significantly（P＜0.01）.ConclusionsWe have successfully established a cisplatin-resistant triple negative breast cancermodel inmice，which provides a new platform for further study on chemoresistant reversal strategy and individualized clinical treatment of this disease.
【Key words】Triple negative breast cancer；Neoplasm drug resistance；Cisplatin；Animalmodels；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0466-08

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.005

2015-04-14

國家自然科學基金資助項目（81373647）。

盛佳鈺（1983ˉ），女，博士研究生，主治醫師，研究方向：中醫藥防治乳腺癌研究。E-mail：shengjiayu@gmail.com

陳紅風。E-mail：chhfluk@126.com