多發(fā)性硬化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李迎霞，關(guān)東升*，任德啟，郭健，吳川杰

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450003）

研究進(jìn)展

多發(fā)性硬化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李迎霞1，關(guān)東升1*，任德啟1，郭健1，吳川杰2

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450003）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，經(jīng)過近2個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，已可以在猴、大鼠、小鼠等動(dòng)物制備EAE模型，在同一種品系動(dòng)物采用不同免疫抗原制備的EAE模型在敏感性和臨床特點(diǎn)具有多樣性。本研究就EAE的發(fā)展史和目前不同品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、不同抗原制備EAE模型的特點(diǎn)做一述評(píng)，對(duì)未來EAE模型的發(fā)展前景進(jìn)行探討。

多發(fā)性硬化；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；模型，動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）亦稱實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）。以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失為病理特征，由于EAE病理改變與人類多發(fā)性硬化（MS）相似，而使其成為MS的理想動(dòng)物模型，在MS的研究中具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的發(fā)展

自18世紀(jì)30年代以來，EAE被廣泛應(yīng)用于MS的實(shí)驗(yàn)研究［1］。EAE在免疫學(xué)特征、發(fā)病特點(diǎn)和病理學(xué)特征上與人類MS的表現(xiàn)非常相似［1ˉ9］。目前，可以通過用組成髓鞘的多肽致敏和病毒感染兩種方式建立EAE模型。最早的EAE模型是使用同種/異種脊髓勻漿（SCH）作為免疫原誘導(dǎo)建立的［1ˉ3］。Rivers等［1］第一次進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的研究，使用兔的腦組織SCH為免疫原，肌肉注射于猴，制備出最早的實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎。1946年，首次使用SCH抗原乳化于完全弗氏佐劑（含有滅活的結(jié)核桿菌），混合成油包水乳狀液，注射于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備出EAE模型，這種急性腦脊髓炎可以持續(xù)數(shù)周，這即是目前已知最早的EAE［4ˉ6］。早期的研究證明，在SCH中導(dǎo)致腦脊髓炎的主要抗原是髓磷脂堿性蛋白（MBP）。1960年，Paterson［5］通過被動(dòng)給予來自致敏動(dòng)物的特異性腦脊髓炎抗原激活的T細(xì)胞，建立了被動(dòng)免疫的EAE。在嚙齒動(dòng)物身上至今尚未觀察到自發(fā)的EAE。在嚙齒動(dòng)物，EAE或被動(dòng)免疫的EAE可以觀察到一個(gè)上升性癱瘓狀態(tài)，開始與尾部張力降低，后肢癱瘓和遲緩性死亡。

2 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的免疫原

Theiler’s病毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)SCH或乳化于弗氏佐劑的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性抗原均可在不同品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其同種品系的不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上誘導(dǎo)EAE。常見的建立EAE的抗原包括髓磷脂堿性蛋白（MBP），蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)（PLP），髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG），髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG），某些非髓性蛋白，如神經(jīng)原蛋白、膠原纖維酸蛋白也參與EAE的發(fā)病［6ˉ10］。這些抗原可以引起強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。

SCH中致敏的主要抗原是MBP，而MBP占髓鞘蛋白的30%～40%［11］，30%～40%的MBP在髓鞘。H-2u小鼠，尤其是B10.PL和PL/J系，Lewis大鼠，是對(duì)MBP高度敏感的品系［12］。對(duì)C57BL/6（B6）是最常見的小鼠品系之一，對(duì)MBP不敏感［13］。

另外，EAE也可以通過被動(dòng)轉(zhuǎn)移特異性T細(xì)胞獲得。在同一品種的動(dòng)物之間，這些被轉(zhuǎn)移的特異性T細(xì)胞遷移到被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與局部炎癥和繼發(fā)性癱瘓。而且，這種能引起被動(dòng)EAE的腦脊髓炎特異性T細(xì)胞，并不需要從敏感品系獲得，非敏感品系的腦脊髓炎特異性T細(xì)胞也可以誘導(dǎo)［14］。

3 誘導(dǎo)FAF的易感性與動(dòng)物種類的關(guān)系

表1 不同研究方案建立大鼠EAE模型的特點(diǎn)［10ˉ19］Tab.1 Characteristics of the rat EAEmodels established by different studies

EAE的敏感性和臨床過程的特點(diǎn)（急性，超急性，慢性或復(fù)發(fā)緩解），取決于以下因素，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的動(dòng)物品種、年齡、性別，甚至動(dòng)物的商業(yè)來源；抗原、及其劑量、物理狀態(tài)及給藥途徑；免疫佐劑的應(yīng)用。表1、2描述了影響EAE發(fā)病特點(diǎn)的研究結(jié)果。

表2 不同研究方案建立小鼠EAE模型特點(diǎn)［10ˉ19］Tab.2 Characteristics of themouse EAEmodels established by different regimens

不同品種和不同品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)EAE的易感性和臨床特點(diǎn)不同，這歸因于主要組織相容性復(fù)合體基因的多樣性表達(dá)［13］。從這個(gè)角度來講，每種動(dòng)物建立的EAE模型在MS的研究中都具有一定的意義。在過去30年中，大鼠和小鼠是建立EAE最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。如表2所示大鼠自行恢復(fù)的急性病程的EAE，提供了研究有關(guān)誘導(dǎo)和恢復(fù)階段的機(jī)制的模型。有些大鼠品系即使給予低劑量抗原的情況下，仍然顯示可預(yù)測(cè)的臨床癥狀和統(tǒng)一的敏感性［16］。大鼠EAE的病理學(xué)特征為在脊髓、腦干和腦實(shí)質(zhì)的血管周圍單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)。大鼠EAE不同與人類MS的主要特點(diǎn)是髓鞘脫失對(duì)大鼠的影響是微乎其微的。因此，引起癱瘓的最重要很可能是水腫和炎癥［17］。而小鼠的病理學(xué)特點(diǎn)與人類相似［18］，在慢性進(jìn)展型病程和復(fù)發(fā)緩解型病程上均可見脫髓鞘特征。小鼠建立EAE的優(yōu)點(diǎn)還包括的敏感品系較多，可用的實(shí)驗(yàn)試劑較多，在轉(zhuǎn)基因小鼠上研究遺傳學(xué)的易感性。

小鼠建立EAE的主要缺陷是相對(duì)于易感大鼠，小鼠通常更難以誘導(dǎo)EAE，小鼠對(duì)EAE相對(duì)抵抗，體現(xiàn)為發(fā)病率和發(fā)病時(shí)間的差異，以及需要佐劑輔助誘發(fā)疾病。除了使用百日咳毒素作為輔助補(bǔ)充外，往往需要多次注射高劑量的抗原［15］。

使用靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如恒河猴和狨猴），在遺傳學(xué)和免疫學(xué)上具有接近人類的優(yōu)勢(shì)［20］。在靈長(zhǎng)類動(dòng)建立EAE，主要表現(xiàn)為慢性病程，急性炎癥和脫髓鞘，伴隨不斷形成新的免疫活性受傷［21］。但使用MBP和MOG誘導(dǎo)靈長(zhǎng)類（獼猴）動(dòng)物，表現(xiàn)為急性病程。病理以廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死、白質(zhì)破壞，從而影響髓鞘及軸突［22］。狨猴對(duì)重組、人類MOG和完全福氏佐劑的乳劑高度易感，相比之下，無百日咳毒素的MBP是一種弱抗原［23］。

4 CFA在FAF建立過程中的影響

大多數(shù)EAE模型的建立方案中均采用完全弗氏佐劑（complete Freun’s adjuvant，CFA），CFA是多種研究中最常應(yīng)用的免疫佐劑，佐劑的作用是通過降低機(jī)體對(duì)抗原的破壞，從而延遲機(jī)體對(duì)抗原的免疫耐受。促進(jìn)抗原的彌散，使抗原逐漸而持續(xù)的對(duì)機(jī)體發(fā)揮免疫原性。另外，在EAE模型的建立方案中多采用分歧桿菌，以擴(kuò)大免疫效應(yīng)，導(dǎo)致淋巴結(jié)增生，主要激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［5，6］。

不論是皮下或者皮內(nèi)注射CFA，均有助于促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。從而激發(fā)多種自身免疫性疾病。然而，單獨(dú)使用CFA本身就能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生眾多的免疫調(diào)節(jié)功能，甚至導(dǎo)致局部皮膚的肉芽腫和壞死。將CFA注射入動(dòng)物足掌底部時(shí)，CFA能夠引起局部慢性疼痛，潛藏有慢性傷害感受性的機(jī)制，可以用于慢性疼痛的研究。鑒于此，在EAE模型建立過程中，注射CFA時(shí)，應(yīng)當(dāng)采用合理的方案，選用恰當(dāng)?shù)膭┝亢瓦m宜的部位。CFA還可以提高EAE模型血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的通透性和導(dǎo)致CNS血管周圍血清蛋白滲出［21］。

在沒有CFA的情況下，使用MBP抗原腹腔注射免疫Lewis大鼠，需要重復(fù)注射抗原的同時(shí)使用次氯酸鈉預(yù)治療（增加淋巴節(jié)對(duì)MBP的吸收程度）和百日咳毒素作為免疫佐劑。另一個(gè)方案是直接注射MBP水溶液到腘窩淋巴結(jié)，并且于致敏前3周給予金屬錫作為致敏劑。

5 發(fā)展新的FAF模型的原則

EAE與人類MS尚存在一定的差距，要建立能夠更好的反映人類MS發(fā)病機(jī)制的EAE模型，必須注意以下幾點(diǎn)［24，25］：①人類與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遺傳學(xué)上的差異，雖然鼠類和狨猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人同屬哺乳動(dòng)物，但是在遺傳學(xué)上還是有巨大的差異；②MS的發(fā)病與環(huán)境密切相關(guān)；③MS臨床病程的特點(diǎn)：建立與人類MS臨床病程特點(diǎn)更加吻合的EAE模型；④病理機(jī)制：MS的病理特征是其區(qū)別與其他疾病的最主要特征；⑤臨床治療反應(yīng)：建立EAE的最終目的是治療MS，因此，建立的EAE要能夠反映MS的臨床治療反應(yīng)。遺傳學(xué)上的差異在任何實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上均存在。目前，研究者幾乎不可避免的使用近交系動(dòng)物，然而臨床治療反應(yīng)才是決定藥物安全性、有效性、代謝的主要因素。

綜上所述，EAE模型的建立是涉及多因素研究工作，選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，抗原、佐劑以及抗原給予部位等因素均能夠影響EAE模型的發(fā)病特點(diǎn)及其病理變化。研究出能夠真實(shí)、準(zhǔn)確還原人類MS特點(diǎn)的EAE，是EAE研究發(fā)展的最終目標(biāo)。與此同時(shí)，研究者需要根據(jù)研究目的選擇恰當(dāng)?shù)腅AE建立方案。

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Research progress of animalmodels ofmultiple sclerosis

LIYing-xia1，GUAN Dong-sheng1，REN De-qi1，GUO Jian1，WU Chuan-jie2
（1.Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China，2.The Frist Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003）

Experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）is a classic animalmodel for multiple sclerosis. Aftermore than 2 centuries of development，EAE can be established inmice，monkeys and rats，etc.Some animals can be immunized by different immune antigenswhich have different features in sensibility and clinical characteristics.In this paper，wewill review the developmentof EAE，discuss the characteristics of EAEmodels produced by immunization of different animals with different antigens.In summary，we explore the development of animalmodels of EAE.

Multiple sclerosis；Experimental autoimmune encephalomyelitis；Models，animal.

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0535-04

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.018

2015-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No.81202657）；河南省中醫(yī)管理局河南省中醫(yī)臨床學(xué)科領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃（No.201301006）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No.13A360556）。

李迎霞（1978ˉ），女，博士，研究方向：多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)研究。

關(guān)東升，博士，副教授，研究方向：多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)研究。Email：gds349@126.com