苦參素對肺癌A549細(xì)胞的放療增敏作用及其機(jī)制

史衛(wèi)林，李堅(jiān)，陸建保，陳萍，陳康

(1溧陽市人民醫(yī)院，江蘇溧陽213300;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院)

近年來，腫瘤的放療技術(shù)已取得了較大進(jìn)展，但仍有部分患者因放射抵抗而導(dǎo)致放療失敗，究其原因主要與腫瘤細(xì)胞對放射線耐受有關(guān)，故尋找對放療有增敏作用的藥物成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的一個熱點(diǎn)。苦參素是中藥苦參的主要活性成分之一，主要從苦參根及苦豆子中提取，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用［1］，也有少量研究表明其有放療增敏作用［2］，但是增敏機(jī)制尚不清楚。2014年3月～2015年3月，我們觀察了苦參素對肺癌A549細(xì)胞的放療增敏作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，苦參素標(biāo)準(zhǔn)品(北京中科儀友化工技術(shù)研究院)，CCK-8試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)，TRIzol試劑盒(Invitriogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒(TaKaRa公司)，DNA PKcs兔抗人單克隆抗體(abcam公司)，β-actin鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠/兔二抗(BD公司)，發(fā)光劑(Millipore公司)，倒置式生物顯微鏡(Olympus公司)，Clinac 600c 6MV X射線(Varian公司)，HT-2型酶標(biāo)儀(Austria公司)，超聲破碎儀(Misonix公司)，蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，熒光定量 PCR分析儀(Stratagene公司)，人肺腺癌細(xì)胞株 A549由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 肺癌A549細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8法。體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL(每孔約5×103個細(xì)胞)。培養(yǎng)12 h后移液槍小心吸取上清，將含有0.5、1.0、2.0、4.0 g/L苦參素的培養(yǎng)基100 μL加入對應(yīng)的孔(實(shí)驗(yàn)組)中，同時設(shè)立空白組和陰性對照組，每孔設(shè)6個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在培養(yǎng)24、48 h于對應(yīng)的各孔中加CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在酶標(biāo)儀上于450 nm處測定吸光度A值。重復(fù)測量3次，取平均值。用空白組調(diào)零后，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率(細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%)。

1.3 Ku70 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量RT-PCR法。根據(jù)細(xì)胞抑制率(細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞增殖率)，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算48 h時苦參素的 IC20值，并以此作為加藥濃度［3，4］。取對數(shù)生長期肺癌A549細(xì)胞，隨機(jī)將肺癌A549細(xì)胞分為對照組、單純藥物組、單純放療組(2 Gy)、藥物聯(lián)合放療組。各組在苦參素和(或)放療干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取RNA，測定RNA濃度，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH:上游引物:5＇-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3＇，下游引物:5 ＇-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3 ＇，產(chǎn)物長度172 bp;Ku70:上游引物:5 ＇-CTCTTGGCTGTGGTGTTCTATGGTA-3＇，下游引物:5＇-TGAGTGAGTAGTCAGATCCGTGGC-3＇，產(chǎn)物長度187 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，定量分析Ku70 mRNA的相對表達(dá)水平。計(jì)算公式

1.4 Ku70蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。分組及苦參素和(或)放療干預(yù)同1.3。各組在苦參素和(或)放療干預(yù)48 h后，裂解細(xì)胞，提取蛋白，采用蛋白試劑盒測定濃度，樣品變性，將蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗孵育后將PVDF膜置于凝膠成像及分析系統(tǒng)暗室中，滴加ECL發(fā)光劑，曝光顯示條帶。使用Lane 1D凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析條帶的灰度，以Ku70/β-actin表示Ku70蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參素對肺癌A549細(xì)胞增殖率的影響 A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度苦參素處理后，細(xì)胞增殖率隨苦參素作用時間的延長及濃度的增大而下降，呈時間依賴性和劑量依賴性。4種濃度的苦參素作用后細(xì)胞增殖率見表1。

表1 不同濃度苦參素處理后A549細(xì)胞增殖率(±s)

表1 不同濃度苦參素處理后A549細(xì)胞增殖率(±s)

注:與0.5 g/L比較，*P＜0.05;與1.0 g/L比較，#P＜0.05;與2.0 g/L比較，△P＜0.05;與同濃度24 h比較，▼ P＜0.05。

細(xì)胞增殖率24 h 48 h苦參素濃度0 g/L(陰性對照組)1.000±0.000 1.000±0.000 0.5 g/L 0.908±0.036 0.892±0.039▼1.0 g/L 0.836±0.043* 0.786±0.024*▼2.0 g/L 0.651±0.060*# 0.588±0.026*#▼4.0 g/L 0.375 ±0.098*#△ 0.297 ±0.149*#△▼

2.2 各組肺癌A549細(xì)胞Ku70 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 肺癌A549細(xì)胞經(jīng)苦參素處理后48 h的IC20值為0.9 g/L。以此為加藥濃度，各組干預(yù)48 h后Ku70 mRNA及蛋白表達(dá)比較見表2。單純放療組中Ku70 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平與對照組比較明顯增高(P＜0.05)。單純藥物組、藥物聯(lián)合放療組的Ku70 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平均明顯低于同等照射劑量的對照組及單純放療組(P＜0.01)。

表2 各組A549細(xì)胞處理48 h時Ku70 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組A549細(xì)胞處理48 h時Ku70 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與單純藥物組比較，#P＜0.05;與單純放療組比較，▼P＜0.01。

組別 n Ku70 mRNA Ku70蛋白對照組6 1.00±0.000 1.20±0.232單純放療組 6 3.64±1.147* 1.33±0.424*單純藥物組 6 0.87±0.280*▼ 0.76±0.176*▼藥物聯(lián)合放療組 6 0.64±0.265*#▼ 0.62±0.156*#▼

3 討論

DNA是放射線作用的主要靶點(diǎn)，放射線的直接作用和電離效應(yīng)產(chǎn)生的自由基共同導(dǎo)致DNA單、雙鏈斷裂損傷，以雙鏈斷裂損傷最為重要。當(dāng)DNA雙鏈?zhǔn)艿綋p傷時，細(xì)胞將通過不同的通路啟動應(yīng)答進(jìn)行損傷修復(fù)。在哺乳動物細(xì)胞中，雙鏈斷裂損傷修復(fù)有兩條通路:同源重組和非同源末端連接(NHEJ)，其中NHEJ通路在雙鏈斷裂損傷修復(fù)中可能起主要作用［5］。人Ku70基因位于染色體22q13，編碼609個氨基酸，相對分子質(zhì)量為69 kD，它與Ku80通過非共價鍵緊密結(jié)合形成的異源二聚體結(jié)構(gòu)稱為Ku蛋白［6］。研究證實(shí)，Ku蛋白是DNA依賴蛋白酶(DNA-PK)復(fù)合物的主要功能單位，而DNA-PK復(fù)合物是DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白激酶，在整個NHEJ過程中具有重要作用［7］。因此，Ku70是目前研究腫瘤細(xì)胞放療敏感性的主要靶點(diǎn)之一。

苦參素(氧化苦參堿)是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分之一，來源于豆科植物苦參的干燥根。近年研究發(fā)現(xiàn)，苦參素有多方面的藥理活性，其中抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，苦參素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗腫瘤新生血管形成以及抑制腫瘤侵襲等［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，苦參素有放療增敏作用［2］，但增敏機(jī)制不甚清楚。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示苦參素能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，這一作用呈時間和劑量依賴性。

研究顯示，Ku70基因高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對放射線耐受，而低表達(dá)則高度敏感［9］。有研究表明，抑制Ku70基因和蛋白的表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞放射線的敏感性，反映了Ku70的表達(dá)與細(xì)胞對放射線的敏感性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，單純放療后肺癌細(xì)胞Ku70 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平明顯增加，表明放射線在殺傷肺癌細(xì)胞的同時，也誘導(dǎo)了Ku70基因及蛋白的表達(dá)增加，NHEJ通路的DNA損傷修復(fù)功能被激活，以抵抗放射線對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，也證明了Ku70在肺癌細(xì)胞對放療的耐受中具有重要作用，其表達(dá)水平可以作為預(yù)測腫瘤對放療敏感性的標(biāo)志，這與 Komuro等［10］研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)用苦參素處理肺癌A549細(xì)胞后Ku70 mRNA及蛋白的表達(dá)水平較對照組下降。同時苦參素聯(lián)合放射線處理肺癌A549細(xì)胞后，Ku70 mRNA及蛋白的表達(dá)較單純放射線處理明顯下調(diào)，也表明了苦參素可以抑制Ku70的表達(dá)，從而影響了DNA的修復(fù)，起到了增加放射線敏感性的作用，這也可能是其放療增敏機(jī)制之一。

綜上所述，苦參素對肺癌A549細(xì)胞具有放療增敏作用。其增敏機(jī)制可能是通過下調(diào)Ku70表達(dá)，抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能來實(shí)現(xiàn)。

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