胸腺基質淋巴細胞生成素對效應T細胞分化功能的影響

林靜，李秀紅，梁磊，王毅，陳海潮，楊征，酉鵬華(陜西省人民醫院，西安710068)

胸腺基質淋巴細胞生成素對效應T細胞分化功能的影響

林靜，李秀紅，梁磊，王毅，陳海潮，楊征，酉鵬華
(陜西省人民醫院，西安710068)

摘要:目的探討體外氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)誘導人血管平滑肌細胞產生的胸腺基質淋巴細胞生成素( TSLP)對效應T細胞分化功能的影響。方法分離并培養人血管平滑肌細胞、人樹突狀細胞( DC)、初始T細胞，隨機分為4組，每組設5個樣本。對照組、實驗組人血管平滑肌細胞分別經PBS、ox-LDL處理后，取其上清液與DC、初始T細胞共培養; TSLP中和抗體組、中和抗體對照組在實驗組的基礎上分別加入TSLP中和抗體、TSLP非特異性中和抗體與DC、初始T細胞共培養。采用ELISA法檢測各組細胞培養上清液中TSLP及Th17細胞因子IL-17、IL-22、TNF-α水平，流式細胞術檢測Th17細胞構成比。結果與對照組比較，實驗組培養上清液TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17細胞構成比升高( P均＜0.01)。與實驗組、中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17細胞構成比降低( P均＜0.01)。結論Ox-LDL體外誘導人血管平滑肌細胞產生的TSLP可促進T細胞向Th17細胞分化。

關鍵詞:胸腺基質淋巴細胞生產素;樹突狀細胞; T細胞; Th17細胞;動脈粥樣硬化

Influence of thymic stromal lymphopoietin on differentiation of effector T cells

LIN Jing，LI Xiu-hong，LIANG Lei，WANG Yi，CHEN Hai-chao，YANG Zheng，YOU Peng-hua
( Shaanxi Provincial People＇s Hospital，Xi＇an 710068，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of thymic stromal lymphopoietin ( TSLP) produced by oxidized-low density lipoprotein ( ox-LDL) -induced human vascular smooth muscle cells in vitro on differentiation of effector T cells.Methods Human vascular smooth muscle cells，human dendritic cells ( DCs) andT cells were isolated and cultured.Then we divided them into 4 groups，and 5 samples in each group.The control group and the experimental group were separately simulated with PBS and ox-LDL.The supernatant was incubated with DCs andT cells.TSLP neutralizing antibody group and neutralizing antibody control group were added with TSLP neutralizing antibody，TSLP non-specific neutralizing antibody，then were co-cultured with DC andT cells.The levels of TSLP and Th17cytokines including IL-17，IL-22 and TNF-α were detected by ELISA，and the flow cytometry was used to detect the proportion of Th17 cells.Results Compared with the control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were increased in the experimental group ( all P＜0.01).Compared with the neutralizing antibody control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were decreased in the TSLP neutralizing antibody group ( all P＜0.01).Conclusion TSLP produced by ox-LDL-induced human vascular smooth muscle cells in vitro could promoteT cells differentiating into Th17 cells.

Key words:thymic stromal lymphopoietin; dendritic cells; T cells; Th17cells; atherosclerosis

TSLP受體結合，在效應性T細胞的分化中起重要作用。但其具體作用機制尚不明確。2013年2月～2014年12月，我們對氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)誘導人血管平滑肌細胞產生的TSLP在效應性T細胞分化中的作用進行了探討。

1　材料與方法

1.1材料淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。重組人粒細胞-巨噬細胞刺激因子( GM-CSF)、重組人IL-4、重組人TNF-α、人TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α ELISA試劑盒購自eBiosience公司。FITC-抗人CD11c抗體、PE-抗人CD4抗體、FITC-抗人IL-17抗體、IgG同型對照抗體、TSLP中和抗體、對照中和抗體、抗人CD3單克隆抗體、抗人CD28單克隆抗體購自Santa Cruz。T細胞分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司。

1.2人血管平滑肌細胞的培養將人血管平滑肌細胞株(購自中國醫學科學院細胞中心)復蘇后，于37℃、飽和空氣濕度、5% CO2培養箱中培養;待細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%的胰蛋白酶+0.01%EDTA消化傳代。以1.0×105/mL接種細胞至直徑25 cm2培養瓶中進行后續試驗。

1.4實驗分組及處理①對照組: PBS與人血管平滑肌細胞共培養24 h，去除細胞，取其上清液與DC共培養24 h，與初始T細胞共培養5 d。②實驗組: ox-LDL( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細胞共培養24 h，去除細胞，取其上清液與DC共培養24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，與初始T細胞共培養5 d。③TSLP中和抗體組: ox-LDL( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細胞共培養24 h，去除細胞，取其上清液與DC共培養24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，在加入TSLP中和抗體( 1 ng/mL)的培養基中與初始T細胞共培養5 d。④中和抗體對照組: ox-LDL ( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細胞共培養24 h，去除細胞，取其上清液與DC共培養24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，在加入TSLP非特異性中和抗體的培養基中與初始T細胞共培養5 d。每組設5個樣本，5 d后，各組共培養系統中加入抗人CD3抗體( 5 μg/mL)及抗人CD28抗體( 5 μg/mL)孵育24 h。

1.5培養上清液中TSLP、Th17細胞因子( IL-17、IL-22及TNF-α)水平檢測采用ELISA法。各組細胞培養結束后，收集培養上清液，按照試劑盒的操作步驟檢測培養上清液中TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α。實驗設雙復孔，重復3次。

1.7統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1四組人平滑肌細胞TSLP水平比較對照組、實驗組、TSLP中和抗體組、中和抗體對照組TSLP水平分別為( 1.83±0.25)、( 28.83±6.54)、( 3.87± 1.02)、( 24.55±2.95) pg/mL。與對照組比較，實驗組上清液TSLP水平升高( P＜0.01) ;與實驗組比較，TSLP中和抗體組TSLP水平降低( P＜0.01) ;與中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組TSLP水平降低( P＜0.01)。

2.2四組培養上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比較見表1。

表1　四組培養上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比較( pg/mL，珔x±s)

2.3四組Th17細胞構成比比較對照組、實驗組、TSLP中和抗體組、中和抗體對照組Th17細胞構成比分別為( 0.87±0.22) %、( 9.88±2.16) %、( 3.42 ±1.15) %、( 9.25±1.83) %。與對照組比較，實驗組Th17細胞構成比明顯升高( P＜0.01) ;與實驗組比較，TSLP中和抗體組Th17細胞構成比下降( P＜0.01) ;與中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組Th17細胞構成比明顯降低( P＜0.01)。

3　討論

Th17是近年來發現的T細胞亞群，其分泌的細胞因子主要有IL-17、IL-6、TNF-α及IL-22［4］。研究顯示，Th17細胞及相關細胞因子在AS患者斑塊局部及循環血中大量表達［5］。AS小鼠伴隨著Th17炎癥反應的激活，而敲除IL-17基因可明顯抑制小鼠AS斑塊形成［6，7］。Th17炎癥反應對AS發生有促進作用，而并非是AS炎癥反應的結果或其“伴隨效應”。

研究表明，微生物、Toll樣受體( TLR)配體以及某些細胞因子如IL-1β均可通過NF-κB途徑誘導上皮細胞、纖維細胞、角質細胞及內皮細胞產生誘導型TSLP［8］。不同細胞類型產生的誘導型TSLP所需的刺激原不同［9］。在人氣管上皮細胞，單獨的TNF-α 或IL-1β刺激可以誘導細胞產生誘導型TSLP［10］;而在小氣道上皮細胞中，只有TNF-α及IL-1β聯合才可導致誘導型TSLP的產生［11］。因此，不同細胞類型能否誘導產生誘導型TSLP，由細胞所處局部微環境決定。本研究發現，ox-LDL刺激人平滑肌細胞產生TSLP，表明人血管平滑肌細胞所處的ox-LDL微環境是產生誘導型TSLP的決定性因素。TSLP一直被認為是Th2炎癥反應的“總開關”，在特異性皮炎、過敏性哮喘等以Th2炎癥反應為主的自身免疫性疾病中起主要作用。然而近期研究表明，TSLP也可誘導向Th17細胞亞群分化。Tanaka等［12］研究發現，單獨刺激可誘導DC導致效應性T細胞向T2分化，但是TSLP與TLR配體聯合共同刺激誘導DC導致效應性T細胞向Th17分化。本研究發現，ox-LDL誘導產生的誘導型TSLP能夠激活DC，導致Th17細胞分化、Th17細胞因子表達增加，其可能機制為ox-LDL可作為配體與TLR結合，與TSLP聯合共同刺激促使初始T細胞向Th17分化。

本研究發現，與對照組比較，實驗組上清液TSLP水平升高，表明ox-LDL可誘導人平滑肌細胞產生TSLP;抗體中和試驗發現，TSLP中和抗體可顯著降低培養上清液TSLP、IL-17、IL-22水平及Th17細胞構成比，從而阻止DC誘導的Th17細胞分化，進一步表明TSLP在DC誘導的Th17細胞亞群分化機制中發揮重要作用。

綜上所述，ox-LDL誘導人平滑肌細胞產生的TSLP可作用于DC，導致效應性T細胞向Th17分化。結合我們前期研究發現的AS斑塊中TSLP表達升高及Th17在AS中的重要作用，認為TSLP在AS中的重要作用之一可能為促使T細胞分化，具體作用及分子機制尚需進一步研究。

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收稿日期:( 2015-06-05)

通信作者簡介:梁磊( 1974-)，男，主任醫師，博士，主要研究方向為動脈粥樣硬化分子生物學機制。E-mail: ll008@163.com

作者簡介:第一林靜( 1979-)，女，主治醫師，博士，主要研究方向為動脈粥樣硬化發病機制。E-mail: linjing.123456789@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81400333)。

文章編號:1002-266X( 2015)29-0004-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R311.1+44

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.29.002