鹽酸曲美他嗪預處理對大鼠腎臟急性缺血再灌注損傷的影響

杜藝，錢白音，魏玉婷，李素霞，李宓

(中山大學附屬第五醫院，廣東珠海519000)

鹽酸曲美他嗪(TMZ)在心肌缺血時能抑制脂肪酸的β氧化、促進葡萄糖氧化利用，改善心肌細胞能量代謝［1］，目前廣泛用于缺血性心臟病的治療。研究發現，腎臟和心肌缺血再灌注損傷(IRI)均存在三磷酸腺苷產生不足、氧自由基大量產生、胞內鈣超載等機制［2～4］;TMZ可通過上述途徑對心肌細胞產生保護作用，但其在腎臟IRI時是否具有相同的保護作用報道較少。2012～2014年我們觀察了TMZ對大鼠腎臟IRI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠90只(中山大學實驗動物中心)，15周齡，體質量(236±10)g;TMZ(法國施維雅藥廠)，血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、IL-18、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，721分光光度計(上海精密科學儀器公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 動物分組與模型制作 隨機將大鼠分為A、B兩組各45只，適應性喂養2 d，溫度約為23℃，濕度60%，12 h交替照明，自由飲水、飲食。第3天，A組給予生理鹽水稀釋的TMZ 10 mg/(kg·d)灌胃5 d，再隨機分為缺血再灌注(IR1)組、缺血再灌注后處理(IPO1)組、假手術(S1)組，每組15只。B組大鼠生理鹽水灌胃，生理鹽水用法、用量同TMZ，再隨機分為缺血再灌注(IR2)組、缺血再灌注后處理(IPO2)組、假手術(S2)組，每組15只。參考Basile等［5］的方法制備缺血再灌注的急性腎損傷動物模型。缺血再灌注后處理(IPO):在缺血45 min后用血管夾同時給予雙側腎臟恢復血供20 s、阻斷血供20 s處理，反復10次后恢復血供。假手術組:手術方法同上，但僅分離出大鼠雙側腎動脈，不進行夾閉。手術后肉眼觀察腎臟恢復灌注，除在0 h時取標本組沒有縫合腹腔，剩余大鼠均逐層縫合腹腔。各組缺血過程保持大鼠肛溫在36.5～37.0℃。

1.3 血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平檢測 分別在末次恢復腎臟血供0、6、12、24、48 h，取 A、B 組缺血再灌注、IPO大鼠各3只分別經眶后靜脈叢采集靜脈血2～3 mL，離心(3 000 r/min)15 min，取血清于-20℃保存，待測SCr、BUN。化學比色法檢測血BUN、SCr;應用ELISA法測定NGAL、IL-18。并在末次恢復腎臟血供0 h取假手術組大鼠血清檢測BUN、SCr、NGAL、IL-18。

1.4 腎臟組織形態學觀察 在各時間點取血清標本后脊椎脫臼法處死大鼠，開腹，迅速摘除腎臟，用冰浴生理鹽水沖洗后，經腎門處橫斷面切一片厚度為2～3 mm的組織片，用100 mL/L甲醛固定，常規脫水、包埋、切片后，行HE和PAS染色。光鏡下觀察形態，參考Paller等［6］的方法進行評分，隨機選擇10個無重疊視野(×200)，每個視野下隨機選擇10處腎小管，共100處腎小管計分，分數越高表示腎小管損傷程度越嚴重。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間血BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評分比較 見表1。

2.2 各組腎形態學變化 S1、S2組腎小球和腎小管未發現明顯異常;IR1、IR2組腎小管上皮細胞混濁腫脹、空泡變性，腎小管明顯擴張，上皮細胞發生變性、壞死，間質充血水腫，基底膜斷裂;IPO1、IPO2組腎小球囊腔增寬，只見部分腎小管有輕度腫脹、變性，腎小管擴張及壞死程度均減輕。

3 討論

急性腎臟IRI多見于低血容量性休克、急性腎動脈阻斷以及腎臟移植、腎擠壓傷、體外震波碎石等情況，可以造成急性腎損傷或使移植腎功能延遲恢復。此外，它也是腎水平以上主動脈手術和急性腎衰的一種常見而又可危及患者生命的并發癥。因此，如何有效防止因急性腎臟IRI而導致的各種急慢性腎臟疾病是一個亟待解決的問題［7］。在腎臟IRI的防治中，丙泊酚、P選擇素單克隆抗體、N-去硫酸肝素等雖有報道［8］，但并未得到廣泛認可和應用，急性腎臟IRI早期藥物治療一直在探索之中，但現階段主要治療手段仍是腎臟替代治療，尤其是持續腎臟替代治療。

TMZ是第一個長鏈3-酮酰基輔酶A硫解酶抑制劑。研究表明，它不僅能通過增強葡萄糖氧化代謝、恢復糖酵解和碳水化合物之間的偶聯，在耗氧較少的情況下產生三磷酸腺苷，同時還可以減輕心肌細胞內酸中毒和高鈣血癥、限制炎癥反應以及減少氧自由基生成等抗IRI，并能降低心臟交感神經活性，目前已廣泛應用于缺血性心臟病的治療［9～11］。

IPO是臨床治療IRI的重要手段，如在冠心病的治療、器官移植中的運用［12］。急性腎IPO對IRI的保護作用已經得到公認，本實驗與急性腎IPO對腎臟的保護作用做對比，進一步觀察TMZ的保護作用。結果顯示，IR1組與IPO1組比較，各時間點各指標比較差異均無統計學意義;IR1組與IR2組比較，在6 h時IR2組的NGAL、IL-18、腎小管損傷程度評分明顯上升;12 h時BUN開始明顯上升，24 h時IR2組的各項指標均顯著高于IR1組，48 h時BUN、SCr仍顯著高于IR1組。IPO1組與IPO2組比較，在6 h時IPO2組的NGAL明顯上升，12 h時除SCr外均有上升，24 h時除NGAL外其他指標均高于IPO1組，48 h時BUN、SCr、腎小管損傷程度評分仍顯著高于IPO1組。說明在實驗前使用SMZ可以減輕腎IRI的程度。同時還發現，IR1組與IPO2組比較，在6 h時IPO2組NGAL明顯上升，12 h時除SCr外其他指標均顯著高于IR1組，48 h時SCr仍顯著高于IR1組。提示實驗前使用SMZ可獲得與缺血后處理相似的效果。綜上所述，在IRI發生前即預防性使用TMZ可以減輕腎功能損傷。

表1 各組不同時間血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評分比較(±s)

表1 各組不同時間血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評分比較(±s)

注:與同組中S1組或S2組比較，*P＜0.05;與IR2組同時間點比較，#P＜0.05;與IPO2組同時間點比較，△P＜0.05;與IPO2組同時間點比較，▽P＜0.05。

組別 BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) NGAL(pg/mL) IL-18(pg/mL) 腎小管損傷程度評分(分A 組IR1組0 h 12.03±3.33 27.81±5.78 67.14± 9.96 489.13±22.03 33±11 6 h 17.56±6.11* 28.01±3.79 160.98±11.34*#▽ 580.23±23.63*#▽ 58±16*#12 h 27.11±2.01*#▽ 26.43±5.23 246.88±20.05*#▽ 828.53±39.01*#▽ 150±36*#▽24 h 30.71±1.93*# 29.55±4.07#▽ 128.42±19.73*#▽ 724.33±17.88*#▽ 322±32*#▽48 h 12.54±1.91#▽ 24.83±6.51#△▽ 70.05± 9.34 490.43±17.56 390±22*IPO1組0 h 12.89±2.56 27.88±5.06 67.14± 9.99 508.89±22.87 32±12 6 h 18.44±6.01* 28.16±3.33 120.27±10.55＊△ 602.23±17.32* 50±14*12 h 20.21±2.04＊△ 28.67±4.99 239.57±19.88＊△ 783.28±19.77＊△ 111±23＊△24 h 21.44±1.63＊△ 28.98±3.33△ 144.32±16.78* 553.23±16.53＊△ 342±19＊△48 h 11.34±1.67#△ 27.53±5.67#△ 82.34± 8.23 550.21±15.54 300±12＊△S1組 12.09±2.03 25.31±4.74 65.09±10.56 487.04±21.09 33±12 B組IR2組0 h 13.39±2.34 27.31±5.61 68.79± 9.67 489.54±23.88 30±10 6 h 17.74±6.17* 28.87±3.83 226.78±11.53* 639.23±23.63* 72±16*12 h 40.18±3.21* 28.24±6.03 384.76±28.93* 1113.54±27.71* 222±12*24 h 41.55±1.88* 50.66±3.77* 285.47±16.34* 932.56±19.99* 553±32*48 h 22.54±1.93* 45.36±6.51* 80.05± 9.66 513.37±16.85 408±27*IPO2組0 h 13.87±3.01 27.54±4.98 69.19±11.23 473.34±22.88 29±13 6 h 18.31±5.02* 28.34±4.07 180.23± 7.99* 627.08±14.37* 50±12*12 h 32.17±3.33* 26.13±6.84 309.73±26.54* 913.01±25.55* 220±21*24 h 29.53±1.80* 43.77±3.01* 174.93±15.22* 799.51±23.22* 423±27*48 h 19.54±1.91* 38.36±5.53* 79.05±13.01 522.83±16.37 380±32*S2組 11.69±2.15 27.34±5.69 67.98±12.37 458.15±20.77 29±10

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