基因表達譜芯片在胰腺癌組織差異表達相關基因篩選中的應用

賈長河，劉志亮，張成偉

(1河南省人民醫院，鄭州450003;2加拿大多倫多大學醫學生物物理系;3加拿大多倫多瑪格麗特公主癌癥中心)

胰腺癌是預后最差的消化系統惡性腫瘤之一，5年生存率低于5%，故早期診斷胰腺癌尤其重要，但其早期診斷困難。目前，基因診斷是其理想的早期診斷方法，如能發現特異性和敏感性均較高的標志性基因，則可實現對胰腺癌的早期診斷。因此，從大量人類基因中篩選出胰腺癌相關基因顯得愈來愈重要。基因表達譜芯片技術為高通量的分析腫瘤變化基因提供了全新的手段，可為研究腫瘤的發生、發展、檢測以及預后提供大量的數據。2012年1月～2013年2月，我們探討了基因表達譜芯片技術篩選胰腺癌組織和癌旁正常組織基因表達譜差異的可行性。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 同期選擇加拿大多倫多瑪格麗特公主癌癥中心收治的胰腺癌患者4例，均經術后病理檢查證實為胰頭部導管腺癌，術前均未行放化療。其中，男2例、女2例，年齡(58±18)歲，分化程度:高分化1例、中分化1例、低分化2例。術中切除的腫瘤標本于15～20min內快速分揀，分別留取癌旁組織(肉眼觀察距離腫瘤邊緣＞5cm，術后病理檢查證實癌旁組織切緣無腫瘤浸潤)及主要腫瘤組織;將癌旁組織和癌組織均分為兩份:一份液氮凍存備用，一份送病理科行常規檢查。

1.2 探針制備及芯片雜交 TRIzol一步法提取各例胰腺癌組織、癌旁正常組織的總RNA，瓊脂糖電泳質檢，純化;一步法合成cDNA第1鏈和第2鏈;aaUTP標記cRNA合成;cRNA純化;cRNA濃度測定;cRNA樣品后標記(以Cy3-dUTP標記癌旁正常胰腺組織樣品，以Cy5-dUTP標記胰腺癌組織樣品);熒光標記cRNA樣品純化;熒光分子濃度及摻入率計算;cRNA樣品片段化。最后將探針加在基因芯片上，恒溫雜交爐內65℃、10 r/min滾動雜交17 h后，揭開蓋玻片，按順序分別在洗液1和洗液2中各洗滌1min，室溫晾干。為消除對照樣本個體差異，對照標本采用TRIzol提取組織總RNA后混合為一個樣本作為統一對照。以上操作參照試劑盒說明書進行。全人類基因芯片4×44K購自美國Agilent公司(G4845A，含27 958個靶基因)。

1.3 熒光掃描和數據分析 ScanArray GX掃描儀掃描芯片，ScanArray Express3.0軟件分析提取兩種熒光信號強度值，滿足以下2個條件的作為有效基因點:①該基因點的Cy3、Cy5信號值皆＞200，或者其中之一＞800;②采用lowess回歸方法標準均一化處理后，該基因點的Cy5/Cy3為0.1～10。芯片上某一點的Cy5/Cy3代表胰腺癌組織與正常胰腺組織基因mRNA表達豐度之比。符合以下條件的基因群認定為差異表達基因:①熒光表現強度差異達2倍以上變化(增加2倍或減少2倍的基因);②P＜0.05的基因(Bonferroni方法計算的假陽性概率)。

1.4 差異基因表達檢測 采用半定量RT-PCR驗證。選取4條不同表達水平的顯著差異基因，包括上調基因(CD151、S100A4)和下調基因(NME3、TIMP-3)各2條，作為驗證基因。設計相應的PCR引物;按RT試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉錄合成cDNA，并以其為模板進行RT-PCR反應。其中，CD151:正義鏈:5'-ACCATTGCTAGTGCTGAGCC-3'，反義鏈:5'-AACTTGGGCTGTGTTGGTCT-3'，引物長度 129 bp;S100A4:正義鏈:5'-CCATCCGATGAAACGTCAAGC-3'，反義鏈:5'-GATGGCTCAGCTGCGAAAGA-3'，引物長度99 bp;TIMP-3:正義鏈:5'-GGAATTCATGACCCCTTGGCTCGGG-3'，反義鏈:5'-GGAATTCAGGGTCTGGCGCTCAGGG-3'，引 物 長 度648bp;NME3:正義鏈:5'-CTGCAGCCGGAGTTCAAACC-3'，反義鏈:5'-GTCTGCCCTCCTGTCATTCA-3'，引物長度187 bp;GADPH內參:正義鏈:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反義鏈:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，引物長度451 bp。反應條件:94℃變性10min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃1min，重復30個循環。采用凝膠電泳、Quantity One軟件分析吸光度確定基因表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以±s表示，比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總RNA質量鑒定和mRNA純化 電泳結果顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，5S rRNA條帶模糊，說明提取的胰腺癌和癌旁正常胰腺組織的總RNA純度和完整性好，符合標準。

2.2 基因表達譜分析 4次芯片雜交結果顯示，陽性對照信號清晰，陰性對照信號均很低，數據可靠。4例患者差異表達基因取交集，共發現46個共同表達差異基因。其中，腫瘤組織表達上調基因有26個(包括已知基因 17個，如 GRB2、ITGA3、MMP-14、S100A4、VEGFA、CCNC、MKI67、PCNA、CDK4、MCM4、HSP90AA1、BCL2、CD151、PRPS1、HRH1、GDF15、RPA3)，下調基因有20個(包括已知基因10個，如 PLCB4、TIMP3、BTG2、TFF1、CLDN3、ITGB8、NME3、AKT3、FHIT、ATP4B)。

2.3 差異基因表達檢測結果 CD151、S100A4在胰腺癌組織中呈高表達，NME3、TIMP-3在胰腺癌組織中呈低表達，與基因芯片結果吻合，說明芯片結果可靠。見表1。

表1 4條顯著差異表達基因RT-PCR半定量分析結果(±s)

表1 4條顯著差異表達基因RT-PCR半定量分析結果(±s)

注:與癌旁正常組織比較，*P＜0.05。

組織類型CD151 S100A4 NME3 TIMP-3胰腺癌組織 8.38±0.81* 7.85±0.39* 1.14±0.15* 1.08±0.17*癌旁正常組織1.04±0.10 1.27±0.18 6.71±0.45 6.69±0.64

3 討論

腫瘤的發生是一個多因素、多步驟、多基因參與的復雜過程，是由一組基因的變化及其相互作用決定的。基因芯片技術可從基因水平對腫瘤的發生、轉移等生物學行為進行研究，從幾千或幾萬條基因中篩選出腫瘤相關基因。而基因表達譜芯片的應用為在全基因組范圍內尋找與腫瘤發生、發展相關的基因變化提供了一個強有力的手段。

本研究利用美國Agilent公司生產的全人類基因表達譜芯片，對胰腺癌組織和癌旁正常胰腺組織的基因表達譜進行研究，共發現46個差異表達基因，其中上調基因26個、下調基因20個;通過RTPCR驗證，差異基因 CD151、S100A4、TIMP-3 和NME3的表達情況與基因表達譜芯片檢測結果一致。表明胰腺癌的發生、發展與多種腫瘤相關基因表達失常或腫瘤抑制基因失活有關，是多個分子生物學過程共同作用所致。

在27個已知基因中，與細胞周期調節有關的有CCNC、MCM4、RPA3等基因。CCNC是一種細胞周期調節蛋白，能夠促進細胞增殖，有學者報道在肝癌細胞增殖早期表達增高［1］。MCM4是微小染色體維持蛋白家族中的一員，通過與復制子結合在DNA復制的起始和延伸過程中起著十分關鍵的作用，能確保DNA的復制在每個細胞周期僅發生1次，屬于一種與DNA復制有關的解鏈酶，在防止DNA過度復制中起關鍵作用。MCM4過度表達與腫瘤細胞的生長有密切關系［2］。以上兩種基因與胰腺癌的關系鮮見報道。本研究中，二者在胰腺癌組織中的表達均上調。RPA3是真核細胞中的一種單鏈結合蛋白，在DNA復制和修復過程中起重要作用，對于細胞調控DNA修復過程至關重要。有研究顯示，RPA1、RPA2在乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、膀胱癌等腫瘤中表達增高［3］，但RPA3在腫瘤中的表達較少見。本研究首次發現RPA3在胰腺癌組織中表達上調。

與細胞黏附、浸潤有關的有 ITGA3、S100A4、CD151等基因。ITGA3是一種介導細胞和其外環境(如細胞外基質)之間連接的跨膜受體;通過與其他蛋白相互作用來介導細胞內外聯系，參與細胞黏附、運動、形態及細胞周期等調節。有研究發現，其在胃癌、腸癌及肝癌組織中表達升高［4］，未見其在胰腺癌組織中表達的報道。本研究發現，該基因在胰腺癌中表達上調。S100A4屬于S100鈣結合蛋白家族成員，參與細胞骨架及胞膜的相互作用以及鈣離子信號傳遞和細胞的分化。S100A4在腫瘤中的作用表現為參與細胞異常增殖、使侵襲和活動能力增強、促進新生血管生長。S100A4在多種腫瘤組織中過度表達，Lee等［5］研究發現，胰腺癌組織中S100A4過表達，與胰腺腫瘤大小、TNM分期及不良預后相關。本研究發現，S100A4基因在胰腺癌組織中表達上調。CD151是四次跨膜蛋白超家族成員之一，對內皮細胞的移行及微血管形成起促進作用，在血管生成及重塑中起關鍵作用，有利于腫瘤細胞的浸潤及轉移。目前的研究認為，它與腫瘤的發生及預后呈正相關［6，7］。本研究發現，CD151 基因在胰腺癌組織中表達上調，與 Zhu 等［8，9］報道一致。

與細胞外基質有關的有MMP-14、TIMP3基因。MMP-14屬于基質金屬蛋白酶家族成員，能降解多種細胞外基質，在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用，在多種腫瘤中呈現過度表達［10］，在胰腺癌組織中的表達鮮見報道。本研究中，MMP-14基因在胰腺癌組織中表達上調。TIMP3屬于基質金屬蛋白酶抑制劑家族成員，存在于細胞外基質中，抑制MMP對細胞外基質的降解，同時也具有誘導細胞凋亡的功能，在多種腫瘤組織中表達下調［11］。本研究中，TIMP3在胰腺癌組織中表達下調。

與細胞生長和凋亡調節有關的有 GDF15、MKI67、BCL2、BTG2、NME3 等基因。GDF15 是 TGF-β超家族成員之一，在生理病理的不同階段，其表達變化會通過多條信號通路導致細胞不同的生物行為。目前的研究發現，其在不同腫瘤組織中表達不一［12～14］。本研究發現，GDF15 基因在胰腺癌組織中表達上調。另外，本研究中MKI67、BCL2在胰腺癌組織中表達上調，BTG2、NME3表達下調。

與信號傳導有關的有 AKT3、GRB2、HSP90AA1、HRH1、PLCB4、FHIT 等基因。AKT3 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，通過影響下游多種效應分子的活化狀態，發揮調節細胞存活、代謝、增殖的作用。目前，關于AKT3基因的報道較少，有學者認為其在胃癌組織中表達上調。本研究中，AKT3基因在胰腺癌組織中表達下調;同時發現，GRB2、HSP90AA1、HRH1基因在胰腺癌組織中表達上調，FHIT、PLCB4基因表達下調。

與細胞通道傳導及運輸有關的有 ITGB8、ATP4B基因。ITGB8是整合素β家族成員，以往研究未見報道。本研究，ITGB8基因在胰腺癌組織中表達下調。ATP4B是H+/K+ATP酶家族成員，與腫瘤關系的研究較少，在胰腺癌未見報道。本研究發現，ITGB8基因在胰腺癌組織中表達下調。

與其他功能有關的基因有PRPS1、TFF1。本研究中，PRPS1基因在胰腺癌組織中表達上調，TFF1表達下調。

綜上所述，應用基因表達譜芯片可以篩選胰腺癌相關基因，是否是胰腺癌特異的敏感基因需要更多病例驗證以及蛋白水平的進一步研究，希望從中能篩選出有助于胰腺癌早期診斷和治療的分子標記物或基因治療靶點。

［1］Wang B，Xun S，Liu JY，et al.The effect of cell cycle and expression of cyclin B1 and cyclin C protein in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and SMMC-7721 after of silencing β-catenin gene［J］.Hepatogastroenterology，2012，59(114):515-518.

［2］Bagley BN，Keane TM，Maklakova VI，et al.A dominantly acting murine allele of Mcm4 causes chromosomal abnormalities and promotes tumorigenesis［J］.PLoS Genet，2012，8(11):e1003034.

［3］Banerjee P，De Jesus R，Gjoerup O，et al.Viral interference with DNA repair by targeting of the single-stranded DNA binding protein RPA［J］.PLoS Pathog，2013，9(10):e1003725.

［4］Bauer KM，Watts TN，Buechler S，et al.Proteomic and functional investigation of the colon cancer relapse-associated genes NOX4 andITGA3［J］.J Proteome Res，2014，13(11):4910-4918.

［5］Lee SH，Kim H，Hwang JH，et al.CD24 and S100A4 expression in resectable pancreatic cancers with earlier disease recurrence and poor survival［J］.Pancreas，2014，43(3):380-388.

［6］Baldwin LA，Hoff JT，Lefringhouse J，et al.CD151-α3β1 integrin complexes suppress ovarian tumor growth by repressing slug-mediated EMT and canonical Wnt signaling［J］.Oncotarget，2014，5(23):12203-12217.

［7］Ha SY，Do IG，Lee J，et al.CD151 overexpression is associated with poor prognosis in patients with pT3 gastric cancer［J］.Ann Surg Oncol，2014，21(4):1099-1106.

［8］Zhu GH，Huang C，Qiu ZJ，et al.Expression and prognostic significance of CD151，c-Met，and integrin alpha3/alpha6 in pancreaticductal adenocarcinoma［J］.Dig Dis Sci，2011，56(4):1090-1098.

［9］Yue S，Mu W，Z?ller M.Tspan8 and CD151 promote metastasis by distinct mechanisms［J］.Eur J Cancer，2013，49(13):2934-2948.

［10］Haage A，Nam DH，Ge X，et al.Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，450(1):213-218.

［11］Gu X，Fu M，Ding Y，et al.TIMP-3 expression associates with malignant behaviors and predicts favorable survival in HCC［J］.PLoS One，2014，9(8):e106161.

［12］Blanco-Calvo M，Tarrío N，Reboredo M，et al.Circulating levels of GDF15，MMP7 and miR-200c as a poor prognostic signature in gastric cancer［J］.Future Oncol，2014，10(7):1187-1202.

［13］Trovik J，Salvesen HB，Cuppens T，et al.Growth differentiation factor-15 as biomarker in uterine sarcomas［J］.Int J Gynecol Cancer，2014，24(2):252-259.

［14］Aw Yong KM，Zeng Y，Vindivich D，et al.Morphological effects on expression of growth differentiation factor 15(GDF15)，a marker of metastasis［J］.J Cell Physiol，2014，229(3):362-373.