參橘止咳滴丸微生物限度檢查法的建立和最大耐受量實驗*

李 娟，封士蘭，郭朝暉

1甘肅省人民醫院，甘肅蘭州730000；2蘭州大學藥學院；3甘肅省食品藥品檢驗所

參橘止咳滴丸微生物限度檢查法的建立和最大耐受量實驗*

李 娟1，封士蘭2，郭朝暉3

1甘肅省人民醫院，甘肅蘭州730000；2蘭州大學藥學院；3甘肅省食品藥品檢驗所

目的：建立參橘止咳滴丸微生物限度檢查方法，并測定其最大耐受量。方法：測定參橘止咳滴丸對5種驗證菌株的回收率，并對控制菌的檢查法進行驗證；同時，小鼠灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/（kg·d）(相當于人臨床用量的2 290.08倍)，觀察14天，記錄有無死亡發生，確定小鼠對參橘止咳滴丸的最大耐受量。結果：回收率試驗結果表明，參橘止咳滴丸供試品試驗菌的回收率試驗均高于70%，證明無抑菌現象；一次性給予高劑量參橘止咳滴丸，經過14天的連續觀察，小鼠無死亡且一般狀態良好。結論：參橘止咳滴丸可按常規方法進行微生物限度檢查，且具有較高的安全性。

參橘止咳滴丸；微生物限度；最大耐受量

參橘止咳滴丸是以甘肅省名中醫徐鴻達主任醫師的臨床經驗方為依據，采用現代制劑技術研制的滴丸劑，其處方主要由玄參、陳皮等中藥組成，具有清熱抗炎，止咳利咽的功效，對外感咳嗽和慢性氣管炎急性發作引起的咳嗽療效確切［1］。本實驗根據2010版《中國藥典》微生物限度檢查法的相關規定，建立參橘止咳滴丸的微生物限度檢查方法，進行方法驗證，并通過最大耐受量試驗來評價其安全性，以期為參橘止咳滴丸開發使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參橘止咳滴丸(甘肅隴神戎發制藥有限公司提供，批號：20061009、20061209、20070214)。

1.2 實驗材料 營養瓊脂培養基；玫瑰紅鈉瓊脂培養基；膽鹽乳糖增菌培養基；大腸埃希菌［CMCC (B)44 102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］，白色念珠菌［CMCC(F)98 001］，黑曲霉［CMCC(F)98 003］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 實驗動物 昆明種小白鼠40只，體質量18～22 g，由蘭州大學實驗動物中心提供［動物實驗合格證號：SYXK(甘)2005-0007］。

1.4 實驗儀器 超凈臺 (蘇州凈化設備公司提供)；電熱鼓風干燥箱(天津市實驗儀器廠提供)；JT75-2型隔水式培養箱(余姚縣恒溫箱廠提供)；電熱恒溫培養箱(南京實驗儀器廠提供)。

1.5 方法

1.5.1 最大耐受量實驗［2-5］取小鼠40只，雌雄各半，按體質量隨機分為給藥組和對照組。給藥組灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/(kg·d)(相當于人臨床用量的2 290.08倍)，對照組灌胃給予同體積的生理鹽水。于末次給藥后觀察小鼠14天內體質量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排便物、死亡情況及中毒反應。對瀕死及死亡動物及時進行解剖，其他動物于觀測結束后進行解剖，當發現器官出現體積、顏色、質地等改變時則對改變的器官進行組織病理學檢查。

1.5.2 微生物限度檢查方法驗證實驗［6-9］

1.5.2.1 菌液制備 取經30～35℃培養18～24小時的枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的肉湯培養物1mL，取經25℃培養24～48小時的白色念珠菌液體培養物1mL，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級地稀釋至10-5～10-7，菌數約為50～100 cfu/mL，做菌液組計數，備用。取經25℃培養7天的黑曲霉斜面培養物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子液1mL加9mL0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級地稀釋為10-4，菌數約為50～100 cfu/mL，備用。

1.5.2.2 供試液制備 稱取供試品10g，至pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，置45℃水浴中使溶解，搖勻，制成1∶10供試液。

1.5.2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證(回收率測定)實驗組：取1∶10的供試液各1mL分別注入2個平皿中，加入50～100 cfu實驗菌，立即傾注涼至45℃的熔化的相應的瓊脂培養基15～20 mL，搖勻，凝固后，將平皿倒置于規定的溫度培養至規定的時間，計數。菌液組：取實驗菌液各1mL，分別放入2個平皿中，立即傾注涼至45℃的熔化的相應的瓊脂培養基15～20 mL，搖勻，凝固后，將平皿倒置于規定的溫度培養至規定的時間，測定所加的驗證菌數。供試品對照組：取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

1.5.2.4 控制菌檢驗方法 取1∶10供試液各10mL，分別加入2瓶各含100mL的膽鹽乳糖增菌液中，其中1瓶加10～100 cfu大腸埃細菌，另1瓶加10～100 cfu金黃色葡萄球菌，置于規定溫度培養至18～24小時。

1.6 統計學方法 運用SPSS 16.0軟件建立數據庫，計量資料以(±s)表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最大耐受量實驗 給小鼠單次灌胃給予參橘止咳滴丸120 g/(kg·d)后，小鼠的精神反應、體毛膚色、呼吸步態、攝食飲水、排泄物及其他情況均無異常，未見明顯毒性反應及死亡情況。見表1—2。2組相比較，小鼠的體質量都明顯增加，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。14天后解剖小鼠，肉眼及顯微鏡檢查未見臟器有明顯病理改變。

表1 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠死亡情況

表2 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠反應情況

表3 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠的體質量變化(±s)g

表3 參橘止咳滴丸最大耐受量實驗小鼠的體質量變化(±s)g

注：*表示與對照組比較，P＞0.05。

組別 只數 0天 7天 14天對照組20 19.76±1.29 26.12±1.99 29.95±3.10給藥組20 19.87±1.24*25.89±2.21*30.00±3.02*

2.2 微生物限度檢查方法驗證實驗 通過對參橘止咳滴丸進行3次獨立的平行實驗，發現實驗組的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率都遠高于70%，符合藥典規定，說明參橘止咳滴丸可以采用常規法進行菌數計數方法驗證。見表4。通過對參橘止咳滴丸控制菌檢查，陰性對照菌組均未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，說明可以采用常規法對參橘止咳滴丸進行控制菌檢驗。見表5。

表4 常規法測定各實驗菌株的回收率 %

表5 控制菌驗證結果

3 討論

3.1 最大耐受量實驗 參橘止咳滴丸處方中的玄參和陳皮均非毒性藥材，亦無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經化學處理(水、乙醇粗提除外)，由于預實驗無法測出該復方制劑的半數致死量(LD50)，提示該中藥復方制劑安全范圍很大，所以改做小鼠最大耐受量實驗［120 g/(kg·d)，相當于人臨床用量的2 290.08倍)。試驗發現：小鼠最大量灌胃給藥后14天內，其在攝食、飲水、糞便、尿液及精神、四肢活動和體質量方面，與對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，表明參橘止咳滴丸安全范圍較大，在正常劑量無毒副作用，服用安全。

3.2 微生物限度檢查方法驗證試驗 本實驗依照《中國藥典》2010年版建立參橘止咳滴丸的微生物限度檢查方法，并對控制菌的進行方法學驗證，其驗證菌株為5種，其中大腸埃希菌代表革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌代表革蘭氏陽性球菌、白色念珠菌代表酵母菌、黑曲菌代表霉菌和枯草芽孢桿菌是代表藥品中常見的污染菌-芽孢桿菌。通過實驗發現參橘止咳滴丸對實驗菌的回收率試驗均高70%，控制菌檢查具有較好的專屬性，因此，其微生物限度檢查可按常規法進行。

［1］ 徐靜汶，劉小花，趙良功，等.高效液相色譜法同時測定參橘止咳滴丸中肉桂酸、橙皮苷和哈巴俄苷含量［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2009，32(3)：313-314.

［2］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛生出版社，2002：886-887.

［3］ 陳奇.中藥藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1993：112-119.

［4］ 傅萍，鄧娟.血竭加味顆粒的急性毒性實驗最大給藥量(最大耐受量)的測定［J］.浙江中醫藥大學學報，2008，32(5)：674-675.

［5］ 葉華，曾茂貴，羅戢彬凱，等.藍花參抗炎、止痛的藥效學與急性毒性試驗研究［J］.西部中醫藥，2012，25(5)：49-51.

［6］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅢ.

［7］ 李曉東，李娟，郭朝暉，等.幾種醫院外用中藥制劑微生物限度檢查方法的建立［J］.西部中醫藥，2012，25(2)：25-27.

［8］ 章紅星，金建平.消炎利膽滴丸微生物限度檢查方法的建立［J］.北方藥學，2011，8(3)：9-10.

［9］ 代心平，諶樂剛.清開靈滴丸微生物限度檢查的方法學驗證［J］.海南醫學，2008，19(12)：87-88.

Study on the Establishm entofM icrobial Lim itand M TD Test for ShenJu ZhiKe D ripping Pills

LIJuan1,FENG Shilan2,GUO Zhaohui3
1 People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy School of Lanzhou University; 3 Gansu Institute for Food and Drug Control

Objective:To establishmicrobial lim it testand measure themaximum-tolerated dose(MTD)of ShenJu ZhiKe dripping pills.Methods:The recovery ratesof5 verified strains treated by ShenJu ZhiKe dripping pills were detected by routinemethod,and them icrobial lim it testmethod for the controlbacteriawas validated;Meanwhile,ratswere observed continuously for14 daysafterbeing given ShenJu ZhiKe dripping pills120 g/(kg·d)by intragastric administration(equivalent to 2290.08 timesof the clinicaldosage),then the dead ratswere recorded and their MTD could be obtained.Results:The recovery rates of ShenJu ZheKe dripping pills for the verified strains were higher than 70%,which indicated no antim icrobialeffectof the pills;in the experimentofMTD,after rats being given ShenJu ZhiKe dripping pills of high dose one time,no rats died for 14-day observation and they were in perfectly good condition.Conclusion:M icrobial limit tests for ShenJu ZheKe dripping pills can be conducted w ith conventionalmethod and thehigher safety can beensured.

Shenju Zhike dripping pills；m icrobial limit test；MTD

R259

A

1004-6852(2015)02-0018-03

2014-08-27

蘭州市科技計劃項目(編號05-1-48)。

李娟(1981—)，女，主治醫師。研究方向：慢性病的康復治療。