RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定避孕貼中炔雌醇與諾孕曲明的含量

張琳杰，劉景彬，張 啟，王 琳，趙永良，謝印芝（天津美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，天津 300400）

避孕貼是一種新型女性避孕工具，主要借助貼劑上的儲(chǔ)藥區(qū)緩慢釋放甾體激素，經(jīng)皮膚滲透進(jìn)入機(jī)體而發(fā)揮避孕作用[1-2]。炔雌醇（Ethinylestradiol，EE）是避孕藥中最常用的強(qiáng)效雌激素，與孕激素配伍可產(chǎn)生協(xié)同作用[3-4]；諾孕曲明（Norelgestromin，NE）是一種孕激素，為炔諾肟酯的活性代謝產(chǎn)物，其與炔雌醇配伍后經(jīng)透皮吸收，可達(dá)到良好的避孕效果[5-7]。目前，同時(shí)測(cè)定炔雌醇及諾孕曲明含量方法的報(bào)道較少。為了更好地控制避孕貼質(zhì)量，提高檢測(cè)效率，在本研究中筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測(cè)定了炔雌醇與諾孕曲明的含量。

1 材料

LC-10A型HPLC儀，包含SPD-10A型紫外檢測(cè)器、Anastar 5.3色譜工作站（日本島津公司）；BS110S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；QYTC-400型超聲波清洗器（滄州全一電子設(shè)備有限公司）。

避孕貼（天津美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào):20140703、20140816、20140908）；炔雌醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100052-200609，純度:99.5%）；諾孕曲明對(duì)照品（加拿大多倫多研究化學(xué)品公司，批號(hào):D28870，純度:99.9%）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:WondaCract ODS-2（150mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇-0.5%磷酸（68∶32，V/V）；流速:1.0ml/min；柱溫:25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):220nm；進(jìn)樣量:20μl。在此色譜條件下，炔雌醇與諾孕曲明的出峰時(shí)間相對(duì)較短（＜30min），峰形較好（對(duì)稱因子均在0.95～1.05之間），兩組分的理論板數(shù)分別以炔雌醇與諾孕曲明峰計(jì)均＞3000，分離度均＞1.5。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取經(jīng)105℃加熱4 h后的炔雌醇與諾孕曲明對(duì)照品各適量，置于同一10ml量瓶中，超聲（功率:200 W，頻率:45 kHz）處理30min后，用70%甲醇溶解并定容，即得。

2.2.2 供試品溶液 取避孕貼（批號(hào):20140703）1片，除去保護(hù)膜剪碎后置于100ml錐形瓶中，加入70%甲醇40ml，浸泡1 h后，超聲（功率:200 W，頻率:45 kHz）處理30min，提取2次，提取液轉(zhuǎn)入100ml量瓶并用70%甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按避孕貼制備工藝制備不含炔雌醇與諾孕曲明的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.決雌醇；2.諾孕曲明Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference solution；B.test solution；C.negative control solution；1.ethinglestradion；2.nordgestromin

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0ml，分別置于10ml量瓶中，加70%甲醇稀釋并定容，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得炔雌醇的回歸方程為y＝16418x－11009（r＝0.9996），諾孕曲明的回歸方程為y＝17965x+11414（r＝0.9997）。結(jié)果表明，炔雌醇、諾孕曲明的質(zhì)量濃度分別在0.872～130.8、0.880～132.0μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 檢測(cè)限與定量限

取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，搖勻，濾過，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，以信噪比為3時(shí)，測(cè)得炔雌醇、諾孕曲明的檢測(cè)限分別為0.014、0.012μg/ml；以信噪比為10時(shí)，測(cè)得炔雌醇、諾孕曲明的定量限分別為0.042、0.036μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣9次，記錄峰面積。結(jié)果，炔雌醇、諾孕曲明峰面積的RSD分別為0.27%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào):20140816）適量，分別于放置0、4、8、12、24、48、60、72h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，炔雌醇、諾孕曲明峰面積的RSD分別為0.29%、0.35%（n＝9），表明供試品溶液在72h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次（批號(hào):20140816）避孕貼片1片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法各平行制備9份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，炔雌醇、諾孕曲明含量的RSD分別為1.03%、0.99%（n＝9），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào):20140816）2ml，各9份，分別加入相當(dāng)于對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度80%、100%、120%的溶液（每個(gè)質(zhì)量濃度3份）各2ml，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

采用2010年版《中國(guó)藥典》（二部）中檢測(cè)炔雌醇的流動(dòng)相[甲醇-水（70∶30，V/V）]對(duì)避孕貼供試品溶液進(jìn)行色譜分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炔雌醇分離度較好，但諾孕曲明無(wú)法與避孕貼中的藥用輔料等其他物質(zhì)完全分離。筆者通過改變流動(dòng)相比例、pH、流速等方法，最終確定甲醇-0.5%磷酸（68∶32，V/V）為本研究的流動(dòng)相。在此條件下，炔雌醇與諾孕曲明分離度良好、峰形較好、出峰時(shí)間相對(duì)較短。

3.2 樣品前處理方法的選擇

根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）及相關(guān)文獻(xiàn)可知，萜類藥物的處理多采用剪碎后溶劑浸泡的方法[8-10]，但該方法所需時(shí)間較長(zhǎng)且提取率低。本研究結(jié)合超聲波輔助方法，將樣品剪碎浸泡一定時(shí)間后超聲處理，這樣不僅縮短了樣品處理時(shí)間，且大大提高了樣品中有效成分（炔雌醇與諾孕曲明）的提取率。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于避孕貼中炔雌醇和諾孕曲明的含量測(cè)定。

[1]武洋洋，高艷麗，劉建平，等.復(fù)方孕二烯酮周效避孕貼劑的體外經(jīng)皮滲透及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（1）:35.

[2]Fiebig DG，Knox S，Viney R，et al.Preferences for new and existing contraceptive products[J].Health Econ，2011，20:35.

[3]劉笑芬，丁存剛，葛慶華，等.柱前衍生LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定血漿中的孕二烯酮、依托孕烯和炔雌醇[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（1）:87.

[4]H?chel J，Schuett B，Ludwig M，et al.Implications of different application sites on the bioavailability of a transdermal contraceptive patch containingethinyl estradiol and gestodene:an open-label，randomized，crossover study[J].Int J Clin Pharmacol Ther，2014，52（10）:856.

[5]Liu X，Ding C，Ge Q，et al.Determination of norelgestromin in rabbit plasma by LC-MS/MS and its application to the pharmacokinetic study of ORTHO EVRA[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（3）:311.

[6]Crosignani PG，Nappi C，Ronsini S，et al.Satisfaction and compliance in hormonal contraception:the result of a multicentre clinical study on women's experience with the ethinylestradiol/norelgestromin contraceptive patch in Italy[J].BMC Womens Health，2009，9（1）:18.

[7]Schwartz JI，Dunbar S，Yuan J，et al.Influence of taranabant，an orally active，highly selective，potent cannabinoid-1 receptor（CB1R）inverse agonist，on ethinyl estradiol and norelgestromin plasma pharmacokinetics[J].J Clin Pharmacol，2009，49（1）:72.

[8]于燕莉，潘菡清，井莉，等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定痹痛寧貼劑中東莨菪堿及烏頭堿的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（1）:65.

[9]丁菊英，王曉娜，王曉坤.HPLC測(cè)定小兒溫里止瀉貼劑中桂皮醛的含量[J].食品與藥品，2014，16（3）:210.

[10]李懷國(guó)，何寶凝，李子鴻，等.HPLC法測(cè)定傷科貼膏中梔子苷的含量及其穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（27）:2544.