復方王不留行片的質量標準研究

趙建穎，盧曉梅，李亮亮，許明哲（洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023）

復方王不留行片是由王不留行、鄰氨基苯甲酸、干酵母、乳酸鈣組成的復方制劑，具有增強體質、通經活血、散結、下乳、消腫、消癰的功效，臨床上用于產后氣血虧損、乳汁不通不下或乳少及乳痛、乳腫等癥。國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第十四冊WS-10001-（HD-1369）-2003未對方中主藥王不留行進行質量控制，文獻報道[1]僅見方中王不留行薄層色譜（TLC）鑒別方法，未見王不留行中王不留行黃酮苷的含量測定方法。為了有效地控制產品質量，筆者建立了TLC法對王不留行進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定方中鄰氨基苯甲酸及王不留行黃酮苷的含量。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括LPG-3400SD型泵、WPS-3000SL型自動進樣器、TCC-3000RS型柱溫箱、VWD-3100型紫外檢測器、Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；92SM-202-A-DR電子分析天平（瑞士Precisa公司）；UV-2401PC型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復方王不留行片（白云山湯陰東泰藥業有限責任公司，批號:130302、120606、130311、131104；焦作市博愛藥業有限公司，批號:110621）。王不留行黃酮苷對照品（批號:111853-201001，純度:91.7%）、王不留行對照藥材（批號:121094-200703）均購自中國食品藥品檢定研究院；鄰氨基苯甲酸對照品（批號:C1305010，純度:99.5%）購自上海晶純生化科技股份有限公司；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇為色譜純，磷酸、乙醇、無水乙醇、三氯化鋁均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 王不留行的TLC鑒別

取本品，除去糖衣，粉碎，取粉末適量（約相當于王不留行1.0 g），置于錐形瓶中，加70%甲醇40ml，超聲（功率:200 W，頻率:40 kHz）處理30min，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取王不留行對照藥材1 g，照上述供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。再取王不留行黃酮苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。再取“2.2.2”項下缺王不留行的陰性樣品適量，照上述供試品溶液的制備方法制成缺王不留行的陰性樣品溶液。按TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以無水乙醇-水（4∶6，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，采用2%三氯化鋁乙醇溶液浸漬法顯色，熱風吹干，置紫外光燈（365nm）下檢視。結果，供試品溶液中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，缺王不留行的陰性樣品無干擾，詳見圖1。

圖1 薄層色譜圖1～3、7～8.5批樣品；4.王不留行黃酮苷對照品；5.王不留行對照藥材；6.缺王不留行的陰性樣品Fig 1 TLC chromatograms1-3，7-8.test sample；4.reference substance of vaccarin；5.reference substance of Vaccaria segetalis；6.negative sample without V.segetalis

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱:YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇為流動相A，0.3%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫，程序詳見表1；流速:1.0ml/min；檢測波長:280nm；柱溫:35 ℃；進樣量:10μl。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液。精密稱取王不留行黃酮苷對照品30.38mg，置于50ml量瓶中，用70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為王不留行黃酮苷對照品貯備液。再精密稱取鄰氨基苯甲酸101.08mg，置于50ml量瓶中，再精密量取上述王不留行黃酮苷對照品貯備液5ml，置于同一50ml量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。（2）供試品溶液。取樣品40片，除去糖衣，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于王不留行1.0 g），置于50ml量瓶中，加70%甲醇30ml，超聲（功率:200 W；頻率:40 kHz）處理30min，放置至室溫，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。（3）陰性對照溶液。按處方比例分別稱取除鄰氨基苯甲酸、王不留行外的其余各成分，按制備工藝分別制成缺鄰氨基苯甲酸、王不留行的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法，制成缺鄰氨基苯甲酸、王不留行的陰性對照溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of the linear gradient elution

2.2.3 系統適用性試驗 精密吸取“2.2.2”項下的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，供試品溶液中鄰氨基苯甲酸和王不留行黃酮苷能達到基線分離，理論板數以王不留行黃酮苷計不低于5500，分離度＞9.2；陰性對照溶液無干擾。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺王不留行的陰性對照；D.缺鄰氨基苯甲酸的陰性對照；1.鄰氨基苯甲酸；2.王不留行黃酮苷Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.test sample；C.negative sample without V.segetalis；D.negative sample without anthranilic acid；1.anthranilic acid；2.vaccarin

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1、3、5、7、10、20μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y王不留行黃酮苷＝21.56x－0.100（r＝0.9999）；y鄰氨基苯甲酸＝3.755x+1.296（r＝0.9999）。結果表明，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的進樣量分別在0.0557～2.2287、2.0114～40.2279μg范圍內與各自峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μl，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次。結果，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的峰面積的RSD分別為0.97%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品（批號:130302）溶液適量，分別于配制0、2、6、8、12h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸峰面積的RSD分別為0.86%、0.79%（n＝6），表明供試品溶液12h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品（批號:130302）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，樣品中王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的平均含量分別為1.0102、32.016mg/g，RSD分別為1.01%、0.68%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號:130302）細粉適量（約相當于王不留行0.5 g），共6份，分別置于50ml量瓶中，分別加入鄰氨基苯甲酸對照品約50mg、“2.2.2”項下王不留行黃酮苷對照品貯備液3.0ml，加70%甲醇30ml，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定并計算加樣回收率，結果詳見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.9 樣品含量測定 取5批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條進行測定，以外標法計算，結果詳見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

精密稱取王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸對照品各適量，用70%甲醇配制成適宜濃度的溶液，照紫外-可見分光光度法在200～400nm范圍內掃描吸收光譜。結果表明，王不留行黃酮苷在280nm波長處有最大吸收，鄰氨基苯甲酸在217、243nm波長處均有最大吸收。由于處方中王不留行黃酮苷的含量相對較低，為使兩種成分都有較好的響應，故選擇280nm作為檢測波長。

3.2 流動相的篩選

參考相關文獻[1-8]，本試驗比較了多種流動相系統，分離效果均不理想。最終選用甲醇-0.3%磷酸溶液作為流動相，通過優化，使樣品中鄰氨基苯甲酸與王不留行黃酮苷色兩組分達到基線分離，陰性對照樣品無干擾，且各組分分離度良好，峰形佳。

3.3 耐用性考察

本文考察了YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo Syncronis C18（150mm×4.6mm，5 μm）等色譜柱對目標化合物分離度和含量測定結果的影響。結果表明，3個不同廠家的同類型色譜柱對樣品含量測定結果沒有顯著影響，含量測定RSD＜2.8%，分離度均＞3.4。

3.4 TLC鑒別中展開系統和溫度的考察

筆者曾采用甲醇-水（4∶6，V/V）、甲醇-水（1∶1，V/V）等展開系統對方中王不留行進行TLC鑒別，但陰性對照樣品均有干擾，效果不佳。最終采用無水乙醇-水（4∶6，V/V）的展開系統，該方法陰性對照樣品無干擾，斑點清晰，分離度好。試驗中筆者還發現，溫度對樣品的分離度有較大影響，溫度高時陰性樣品干擾大，斑點分離度差，因此TLC鑒別時應控制溫度在20℃以下。

3.5 含量測定結果分析

由本研究結果可知，不同廠家樣品中王不留行黃酮苷的含量相差極大，且低于2010年版《中國藥典》（一部）[1]中對王不留行藥材最低限量（0.40%）的規定。分析原因，主要是由于原質量標準中無王不留行質量控制，廠家投料用飲片含量差異所致。為了更好地控制復方王不留行片的質量，保證用藥安全、有效，有必要建立王不留行黃酮苷的含量控制標準。

綜上所述，該方法操作簡便、快捷，結果準確、重復性好，可作為復方王不留行片的質量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:49、附錄ⅥB.

[2]王玉霞，殷永偉，耿琴.HPLC測定腎石通顆粒中王不留行黃酮苷的含量[J].數理醫藥學雜志，2012，25（5）:557.

[3]韓晉，李娜，劉冬，等.復方靈芝乳膏中王不留行黃酮苷含量測定方法研究[J].解放軍藥學學報，2012，28（5）:415.

[4]孟賀，陳玉平，秦文杰，等.HPLC測定王不留行中王不留行黃酮苷的含量[J].中國中藥雜志，2010，35（16）:2072.

[5]張輝，陳乃江.HPLC法測定復方王不留行片中鄰氨基苯甲酸的含量[J].現代中藥研究與實踐，2009，23（4）:63.

[6]王小雪，鄭文捷，謝國祥，等.高效毛細管電泳同時測定板藍根中水楊酸、丁香酸、苯甲酸和鄰氨基苯甲酸[J].中國中藥雜志，2009，34（2）:189.

[7]方建國，萬進，湯杰，等.大孔吸附樹脂分離純化大青葉有機酸部位的實驗研究[J].中國藥房，2007，18（16）:1214.

[8]王文清，張飛，方建國，等.反相高效液相色譜法測定大青葉中鄰氨基苯甲酸與丁香酸的含量[J].醫藥導報，2005，25（5）:456.