HPLC法測定藤梨根中異秦皮苷的含量

馬秉智，周宇，赫軍，趙鐵，李淑芳（中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029）

藤梨根為獼猴桃科植物中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.的干燥根，具有清熱解毒、活血散結(jié)、祛風(fēng)利濕之功效，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)結(jié)核、跌打損傷、癰癤等[1]。現(xiàn)代研究表明，其對胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、大腸癌均有作用[2]。郭潔等[3]報(bào)道藤梨根提取物對人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。孫春霞等[4]報(bào)道含有藤梨根的“化濁解毒方”可降低模型裸鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達(dá)，聯(lián)合用藥療效更佳。關(guān)于藤梨根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，邸學(xué)等[5]對藤梨根藥材進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜及質(zhì)量研究，并測定了其中熊果酸、齊墩果酸的含量[6]，但是它們的含量均不超過0.1%。還有滕坤等[7]測定了藤梨根中大黃素的含量，但其含量僅為6.30μg/g。為此，筆者通過研究藤梨根的化學(xué)成分[8]，發(fā)現(xiàn)了其中一個(gè)含量較大的成分——異秦皮苷，而且是從獼猴桃科中首次分離得到。本研究將其作為質(zhì)控指標(biāo)，并采用HPLC法對藤梨根藥材進(jìn)行含量測定，為藤梨根的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

LC-10A型HPLC儀（日本島津公司）；BSA4235-CW電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

異秦皮苷對照品（中日友好醫(yī)院自制，純度＞98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

藤梨根分別購自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心,產(chǎn)地:四川，產(chǎn)品批號(hào):209061，生產(chǎn)日期:2012年9月6日；北京衛(wèi)仁中藥飲片廠，產(chǎn)地:浙江，產(chǎn)品批號(hào):113612101，生產(chǎn)日期:2012年6月4日；北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，產(chǎn)地:河北，生產(chǎn)批號(hào):001003287，生產(chǎn)日期:2010年9月6日。經(jīng)中日友好醫(yī)院中藥庫唐永和藥師鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬植物軟棗獼猴桃Actinidia chinensis Planch.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm），C18預(yù)柱（4.0mm×3.0mm）；流動(dòng)相:乙腈-1%乙酸溶液（8∶92，V/V）；流速:1.0ml/min；檢測波長:350nm；柱溫:25 ℃；進(jìn)樣量:10μl。色譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取異秦皮苷對照品9.90mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置于100ml圓底燒瓶中，加入甲醇25ml，稱定質(zhì)量，回流提取30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白對照溶液的制備

精密移取甲醇25ml，置于100ml圓底燒瓶中，按供試品溶液的制備方法制成空白對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.空白對照；B.對照品；C.供試品；1.異秦皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.negative control；B.control；C.test sample；1.isofraxoside

分別精密移取對照品溶液0.5、1、2、4、8ml至10ml量瓶中，加甲醇定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到異秦皮苷的回歸方程為y＝14893x+1289.5（r＝0.9999）。結(jié)果表明，異秦皮苷質(zhì)量濃度在9.9～156.4μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取同一異秦皮苷對照品溶液10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，異秦皮苷峰面積的RSD為1.5%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一供試品溶液10μl，分別于放置0、2、4、6、8、10、12h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，異秦皮苷峰面積的RSD為1.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一樣品（批號(hào):001003287）適量，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，異秦皮苷含量的RSD為1.0%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的河北產(chǎn)藤梨根樣品（批號(hào):001003287）約0.50 g，共6份，分別加入一定量的異秦皮苷對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

分別取不同產(chǎn)地的3批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中異秦皮苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

筆者考察了甲醇超聲提取10、20、30min和甲醇回流提取30、60min 5種提取方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇回流提取30min，測得的異秦皮苷的含量最高，故最終確定甲醇回流提取30min作為本研究的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇

分別將異秦皮苷對照品溶液在200～800nm波長范圍內(nèi)作全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在350nm波長下有最大吸收，因此選擇350nm作為本研究的檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇

分別將甲醇-1%醋酸、甲醇-1%甲酸、乙腈-1%醋酸作為流動(dòng)相，按不同比例進(jìn)行研究。最終發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-1%醋酸（8∶92，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)，峰形、分離度效果較佳。

3.4 關(guān)于異秦皮苷的研究

筆者查閱近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)異秦皮苷的報(bào)道[9]很少，且主要是化學(xué)成分方面的研究。但是，它是否具有藥理活性、是否是藤梨根的活性成分，尚有待于進(jìn)一步研究。

[1]北京市藥品監(jiān)督管理局.北京市中藥飲片炮制規(guī)范:2008年版[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008:107.

[2]龍凱花，王小平，白吉慶，等.中藥藤梨根抗腫瘤研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15（10）:846.

[3]郭潔，王小平，白吉慶.藤梨根提取物對人胃癌BGC細(xì)胞凋亡及Bax蛋白表達(dá)的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（13）:12.

[4]孫春霞，李佃貴，閆翠環(huán)，等.化濁解毒方對裸鼠人胃癌原位移植瘤VEGF與COX-2的影響[J].中國藥房，2012，23（19）:1735.

[5]邸學(xué)，王海波，楊欣欣，等.藤梨根藥材HPLC指紋圖譜及質(zhì)量研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）:135.

[6]邸學(xué)，王海波，翟延君，等.HPLC測定藤梨根中熊果酸、齊墩果酸的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（1）:66.

[7]滕坤，于思文.高效液相色譜法測定藤梨根中大黃素的含量[J].通化師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，35（3）:42.

[8]赫軍，馬秉智，趙鐵，等.藤梨根的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（3）:184.

[9]劉宏偉，姚新生，王乃利，等.長柄七葉樹的化學(xué)成分[J].中國天然藥物，2005，3（6）:350.