微流控芯片非接觸電導(dǎo)法測(cè)定僵蠶中草酸銨的含量Δ

楊秀娟，陳纘光，陳倩瑜（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 51080；.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；.佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院，廣東佛山 5811）

僵蠶來(lái)源于蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥體，具有催眠、抗驚厥、息風(fēng)止痙、清熱解毒、祛風(fēng)化痰及散結(jié)等功效[1]。而相關(guān)研究表明，僵蠶抗驚厥作用的主要有效成分是其體表白色粉末中含有的草酸銨[2]。不同的產(chǎn)地、不同的炮制方法以及白僵菌的繁殖條件都會(huì)影響僵蠶中草酸銨的含量[3]。目前，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于僵蠶中草酸銨含量測(cè)定的方法主要有高效液相色譜法[4-5]、高效毛細(xì)管電泳法[6]、示波電位滴定法[7]、高錳酸鉀氧化還原滴定法[8]等。高效液相色譜法的應(yīng)用范圍廣、分離效率高、定量效果好，為目前最為常用的分析方法，但其流動(dòng)相消耗大，且多為有毒的有機(jī)溶劑，對(duì)操作者和環(huán)境有一定的危害，另分析成本相對(duì)較高。而高效毛細(xì)管電泳法雖然需樣量少、靈敏度高，但是毛細(xì)管容易損壞。示波電位滴定法是將高錳酸鉀法與示波器結(jié)合起來(lái)指示終點(diǎn)的方法，該方法比高錳酸鉀氧化還原滴定法更為直觀靈敏、簡(jiǎn)便快速，但是滴定結(jié)果專屬性差，準(zhǔn)確性易受溫度、酸度、滴定速度的影響。使用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測(cè)的方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者建立了采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)法測(cè)定僵蠶中草酸銨的含量。該方法儀器集成程度高、操作簡(jiǎn)單，使用具有強(qiáng)分離效能的微流控芯片進(jìn)行分離，而所用的非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)避免了電極與溶液接觸，壽命長(zhǎng)，成本低，靈敏度較高，為僵蠶的質(zhì)量控制提供一種高效、準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料

PMMA（Polymethyl methacrylate，聚甲基丙烯酸甲酯）十字通道芯片（微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm，進(jìn)樣通道為十字結(jié)構(gòu)，分離通道長(zhǎng)44 mm，有效分離長(zhǎng)度43 mm。大連理工大學(xué)微系統(tǒng)研究中心提供）；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器（兩電極間的距離0.6 mm。中山大學(xué)藥學(xué)院提供）[9]；微型壓電陶瓷高壓電源（中山大學(xué)藥學(xué)院提供）[10]；SHZ-D（Ⅰ）型循環(huán)水式真空泵（鞏儀市英峪予華儀器廠）；色譜工作站（中山大學(xué)醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所），數(shù)據(jù)記錄與處理在普通P4微機(jī)上完成。

僵蠶（購(gòu)自北京同仁堂廣州藥業(yè)連鎖有限公司，產(chǎn)地：四川，批號(hào)：20140702、20140703、20140704），經(jīng)中山大學(xué)姚美村副教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥體；草酸銨對(duì)照品（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，純度≥99.5%）；2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?jí)純）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，F(xiàn)arca Chemical Supplies，優(yōu)級(jí)純）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為二次蒸餾水。所有試劑使用前均經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

緩沖體系：3 mmol/L Tris+3 mmol/L檸檬酸（pH＝3.0）；分離電壓：2.0 kV；進(jìn)樣時(shí)間：10.0 s；不加添加劑；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器激發(fā)電壓：60 V（Vp-p）；頻率：60 kHz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取草酸銨對(duì)照品0.010 0 g，加水溶解并定容于10 ml量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/ml的對(duì)照品貯備液，于4 Ⅰ下保存。臨用前用緩沖溶液稀釋成各濃度的對(duì)照品溶液。由于對(duì)照品溶液中所含的緩沖溶液配比與電泳介質(zhì)的配比相同，因此可以消除背景干擾。進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.2 供試品溶液 取僵蠶樣品適量，研碎，取約1.0 g，精密稱定，將其轉(zhuǎn)移至50 ml錐形瓶中，加入30 ml二次蒸餾水，后將錐形瓶放入50 Ⅰ恒溫水浴鍋中加熱2 h，并不時(shí)用玻璃棒進(jìn)行攪拌。然后過(guò)濾，濾渣加入少量二次蒸餾水繼續(xù)加熱提取，充分提取僵蠶中的草酸銨，得到的待測(cè)樣品溶液再用濾紙過(guò)濾至100 ml量瓶中，定容，于4 Ⅰ下保存?zhèn)溆茫鳛楣┰嚻焚A備液。臨用時(shí)用緩沖溶液稀釋10倍，作為供試品待測(cè)液，使得待測(cè)液中的緩沖溶液配比與電泳介質(zhì)中的相同，消除背景干擾。進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 緩沖溶液種類

考察不同種類緩沖溶液對(duì)草酸銨分離檢測(cè)的影響。在NaH2PO4-Na2HPO4、NaH2PO4-硼砂、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，草酸銨不出峰；在Tris-硼酸緩沖溶液中，雖然基線較為穩(wěn)定，草酸銨出峰明顯，但峰形較差，且為3個(gè)峰（如圖1中A圖所示）；在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，草酸銨出峰明顯、峰形較好，但基線不穩(wěn)定（如圖1中B圖所示）；在Tris-檸檬酸緩沖溶液中，基線穩(wěn)定，基線噪音較低，草酸銨峰響應(yīng)高、峰形較好、出峰時(shí)間短，是較理想的緩沖溶液（如圖1中C圖所示）。因此，優(yōu)化選擇Tris-檸檬酸作為緩沖溶液。

2.4 線性關(guān)系考察和檢測(cè)限

按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度為1.0～200 μg/ml的系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得草酸銨的回歸方程為y＝0.755 4x+2.037（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，草酸銨質(zhì)量濃度在10～150 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限為3.0 μg/ml（以信噪比為3計(jì)算）。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1.00 mg/L的草酸銨對(duì)照品溶液5.00 ml，加入緩沖溶液稀釋100倍，得50 μg/ml的草酸銨對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

圖1 草酸銨在不同緩沖溶液中的芯片毛細(xì)管電泳色譜圖A.Tris-硼酸；B.醋酸-醋酸鈉；C.Tris-檸檬酸；1.草酸銨Fig 1 Microchip capillary electropherograms of ammonium oxalate in different buffer solutionsA.Tris-H3BO3；B.HAc-NaAc；C.Tris-citric acid；1.ammonium oxalate

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140702）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品待測(cè)液，4 Ⅰ下保存，分別于放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.8%，表明供試品待測(cè)液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次的樣品（批號(hào)：20140702）適量，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品待測(cè)液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品貯備液1 ml（批號(hào)：20140702），共9份，分別置于10 ml量瓶中，加入草酸銨對(duì)照品（1.00 mg/ml），然后加入適量的緩沖溶液，定容至10.0 ml。按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下供試品待測(cè)液和對(duì)照品溶液（經(jīng)緩沖溶液適當(dāng)稀釋）適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄電泳圖，見(jiàn)圖2。

取3批樣品（批號(hào)：20140702、20140703、20140704），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品待測(cè)液，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算出草酸銨的質(zhì)量濃度，從而得出其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 芯片毛細(xì)管電泳譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.草酸銨；2、3.未知物Fig 2 Microchip capillary electropherogramsA.reference；B.test samples；1.ammonium oxalate；2-3.unknown impurities

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 緩沖溶液

草酸銨在各種不同緩沖溶液的出峰情況結(jié)果見(jiàn)“2.3”項(xiàng)。草酸銨在NaH2PO4-Na2HPO4等緩沖溶液中不出峰，可能與緩沖溶液的電導(dǎo)與樣品的電導(dǎo)相差不大有關(guān)；而在Tris-硼酸緩沖溶液中分為3個(gè)峰，可能是由于草酸銨與緩沖溶液中的硼酸生成了配合物；在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，基線不穩(wěn)定，可能是由于緩沖溶液離子強(qiáng)度過(guò)大。因此，最后優(yōu)化選擇Tris-檸檬酸作為緩沖體系。

除了種類，緩沖溶液中兩組分比例和濃度對(duì)分離檢測(cè)也有較大的影響。筆者分別考察了Tris（2～5 mmol/L）和檸檬酸（2～5 mmol/L）不同濃度配比的緩沖體系對(duì)分離檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩組分中Tris配比低時(shí)，峰形出現(xiàn)拖尾，可能是因?yàn)榈碗x子強(qiáng)度的緩沖液造成了樣品的吸附；當(dāng)Tris配比高時(shí)，峰形得到改善，但靈敏度下降；當(dāng)檸檬酸配比高時(shí)，基線噪音增加。結(jié)果顯示，兩者比例為1∶1時(shí)，峰形與基線均較好。因此，優(yōu)化Tris和檸檬酸比例為1∶1。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著Tris和檸檬酸總體濃度的增大，電流也隨著增大，焦耳熱效應(yīng)使基線噪聲也隨之增加，影響分離檢測(cè)效果。因此，綜合考慮基線噪音及穩(wěn)定性、出峰情況等分離檢測(cè)效果，優(yōu)化選擇3 mmol/L Tris+3 mmol/L檸檬酸（pH＝3.0）作為緩沖體系。

3.2 添加劑

一般情況下，向背景電解質(zhì)中加入添加劑可影響電滲流、遷移率和控制焦耳熱等，從而改善電泳分離分析效果。試驗(yàn)中考察了乙醇、甲醇、丙酮、丙二醇、β-環(huán)糊精（β-CD）、十二烷基磺酸鈉（SDS）等幾種添加劑不同添加量對(duì)分離檢測(cè)效果的影響。結(jié)果顯示，加入乙醇（1%～5%，體積分?jǐn)?shù)，下同）、甲醇（1%～5%）以及丙酮（1%～5%）后，雖然草酸銨峰形變好，但基線漂移，這可能是由于醇類和酮類物質(zhì)具有揮發(fā)性，從而導(dǎo)致基線上飄；加入丙二醇（1%～5%）后，峰形變差，重復(fù)性不好，而且基線不穩(wěn)定，這可能是丙二醇的黏度大及其吸濕性造成；加入β-CD（5%～10%）和SDS（5%～10%），對(duì)分離檢測(cè)無(wú)改善，且基線不穩(wěn)定，噪音增大。綜合上述檢測(cè)效果，優(yōu)化選擇緩沖溶液中不加添加劑。

3.3 進(jìn)樣時(shí)間

筆者又考察了進(jìn)樣時(shí)間為5.0～20.0 s時(shí)對(duì)草酸銨分離和檢測(cè)的影響。隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)，峰高與峰面積呈增大趨勢(shì)；但當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)10.0 s后，峰高增加的幅度減少，這可能是由于進(jìn)樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，進(jìn)樣量超出了芯片檢測(cè)的載樣量；而且隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，峰出現(xiàn)展寬和拖尾。綜合考慮，優(yōu)化選擇進(jìn)樣時(shí)間為10.0 s。

3.4 分離電壓

在微流控芯片系統(tǒng)中，分離電壓的大小可以直接影響電場(chǎng)強(qiáng)度的大小，從而影響物質(zhì)的遷移速度。而增加組分的遷移速度是減少譜帶展寬、提高分離效率的重要途徑。因此，本研究考察了分離電壓1.0～2.5 kV對(duì)樣品檢測(cè)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著分離電壓的增加，峰高逐漸增加，峰形尖銳，出峰時(shí)間縮短，信噪比增加。但是，過(guò)高的分離電壓可產(chǎn)生較大的電流，使電泳體系產(chǎn)生大量的焦耳熱，基線噪音隨之增大、信噪比下降，從而影響檢測(cè)效果。綜合考慮峰形、靈敏度、噪音以及出峰時(shí)間等因素，優(yōu)化選擇分離電壓為2.0 kV。

綜上所述，該方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，為僵蠶的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：352.

[2]徐沖，商思陽(yáng)，劉梅，等.僵蠶化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2014，25（39）：3 732.

[3]趙清，徐月清，馮天鑄，等.不同炮制方法對(duì)僵蠶指標(biāo)性成分的含量影響研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（3）：657.

[4]張琦，嚴(yán)鑄云，宋杰，等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地僵蠶中草酸銨含量[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（5）：915.

[5]彭新君，許光明，李明娟，等.高效液相色譜法測(cè)定僵蠶中草酸銨的含量[J].中南藥學(xué)，2006，4（4）：255.

[6]黃蓋群，劉剛，江生，等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定中藥材白僵蠶抗驚活性成分方法的探討[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（3）：849.

[7]丁亞平，吳慶生.示波電位滴定法測(cè)定僵蠶中草酸銨[J].分析試驗(yàn)室，1997，16（5）：14.

[8]彭新君，彭延古，曾序求，等.僵蠶提取液中蛋白質(zhì)和草酸銨等成分的定量分析[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（9）：39.

[9]Chen Z，Li Q，Li O，et al.A thin cover glass chip for contactless conductivity detection in microchip capillary electrophoresis[J].Talanta，2007，71（5）：1 944.

[10]陳纘光，王立世，莫金垣.微全分析系統(tǒng)專用微型電源的研制[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（增刊）：26.