人血清白蛋白誘導人腎小管上皮細胞對Egr-1表達的影響*

吳丹彤 李均 姚蘭

終末期腎衰竭是各種慢性腎臟病的晚期，而腎間質纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性腎臟疾病進展至終末期腎病的共同途徑。蛋白尿是多種腎臟疾病常見的癥狀，是腎小球疾病中最常見的臨床表現之一，其不僅反映腎小球損傷的程度，且大量實驗研究表明，蛋白尿是慢性腎病進展的獨立致病因素[1]。研究發現，尿蛋白的主要成分是白蛋白，對近端腎小管上皮細胞存在直接損害作用，白蛋白過度重吸收與腎小管上皮細胞增殖、凋亡失衡以及表型轉分化等有密切關系[2]。因此，蛋白尿是公認的能反映多種腎臟病預后的因素，也是引起小管間質損傷及腎臟疾病的重要因素。早期生長反應因子（Early growth response gene-1，Egr-1）能被低氧、缺血、多肽生長因子及尿素等多種刺激因素誘導，并能調控下游多種基因的表達，參與細胞的生長、分化、增殖和凋亡[3]。Egr-1可通過促進轉化生長因子-β（TGF-β）表達，細胞外基質（ECM）積聚進一步參與腎纖維化[4-5]。本研究擬觀察人血清白蛋白超載人腎小管上皮細胞（HK-2）對Egr-1表達的影響，以進一步探討白蛋白對HK-2的損害機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細胞購自廣州凱基，胎牛血清（Gibco公司），RPMI-1640培養基（Gibco公司），人血清白蛋白（純度98%、Sigma公司），小鼠抗人Egr-1單克隆抗體（Abcam：產品編號ab55160），SDS電泳凝膠試劑盒、BCA蛋白檢測盒、ECL化學發光底物、羊抗小鼠二抗（均購自武漢博士德），脫脂奶粉（購自Sigma，美國）。

1.2 主要儀器 SW-CJ-2F（標準型）雙人雙面垂直工作臺；二氧化碳培養箱（HF90）；臺式高速冷凍離心機（D37520） Thermo Fisher，德國；DY-CZ-24D型電泳槽，北京市六一儀器廠；DYY-2C型電泳儀，北京六一儀器廠；半干轉印儀，美國BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組 將HK-2細胞于含10%胎牛血清1640培養基、培養條件5% CO2，37 ℃培養。每2~3天換液1次，每3~5天傳代1次。鏡下觀察細胞生長至90%~95%融合時，用0.25%胰酶消化后，待鏡下觀察細胞間隙增大后移除胰酶加入含10%胎牛血清1640培養液終止消化，按1∶2~1∶3傳代。待細胞長至90%~95%融合時，用無血清培養基同步化24 h。細胞隨機分為A、B、C、D四組并分別給予不同濃度的人血清白蛋白培養，A組濃度為0 mg/mL、B組濃度為10 mg/mL、C組濃度為20 mg/mL、D組濃度為40 mg/mL，實驗分別觀察24、48和72 h。

1.3.2 觀察指標及方法 免疫印跡檢測Egr-1的表達：HK-2細胞經藥物處理后分別于24、48和72 h收集細胞，用4 ℃預冷的PBS漂洗3次，加入100 μL細胞裂解液（每1 mL裂解液內含10 μL蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min后刮下細胞，收集于1.5 mL EP管中，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳完畢后用BIO-RAD半干轉印儀將蛋白轉移至0.45 μm NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min后，先用小鼠抗人Egr-1單克隆抗體（Abcam公司，1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗4次，洗膜10 min/次，再加入羊抗小鼠IgG抗體（博士德公司，1∶3000稀釋）室溫下孵育2 h，最后經ECL化學發光底物在X片上顯色并曝光成像，掃描X光片結果條帶后，Image-Pro Plus 6.0測定光密度值，使用特異性基因光密度/管家基因光密度（42KD β-actin）相對定量比較。

1.4 統計學處理 使用SPSS 16.0統計軟件進行分析，每組實驗分別重復3次，計量資料采用（s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，LSD法檢驗比較組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

人血清白蛋白對腎小管上皮細胞Egr-1蛋白表達的影響如下：表1示24 h時與A組比較，B、C、D組Egr-1蛋白相對表達均有不同程度升高，其中B、C組差異無統計學意義（P>0.05），D組Egr-1相對表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；48、72 h與A組比較，B、C、D組Egr-1相對表達均有不同程度升高，其中B組差異無統計學意義（P>0.05），C、D組Egr-1相對表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。說明藥物組Egr-1相對表達隨人血清白蛋白濃度增加及時間延長呈逐漸增加趨勢，見圖1。

表1 人血清白蛋白對腎小管上皮細胞Egr-1/β-catenin表達的影響

圖1 人血清白蛋白對腎小管上皮細胞Egr-1、β-catenin蛋白表達的影響

3 討論

RIF是慢性腎臟病發展成終末期腎病的主要病理基礎，是各種腎臟疾病進展至終末期腎功能衰竭的共同途徑，是臨床加重慢性腎衰進程的重要環節[6]。蛋白尿是腎臟損傷的重要標志，蛋白尿的程度是預測多種腎臟疾病嚴重性和惡化趨勢的重要指標，同時蛋白尿也作為一個獨立的致病因素參與腎臟疾病進展[7]。體外實驗表明，蛋白尿的主要成分白蛋白是促腎小管間質纖維化的主要因素，超負荷的尿蛋白轉運至腎小管中會引起腎間質炎癥和免疫反應的發生，可介導白介素-8（IL-8）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、TGF-β及一氧化氮等因子表達，這些因子在促進腎小管間質損害中起重要作用[8-9]。腎小管上皮細胞轉分化（TMET）是腎小管間質纖維化的病理基礎，實驗表明白蛋白可誘導TGF-β、整合素連接激酶（ILK）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、鈣粘附蛋白E（E-cadherin）及纖連蛋白（FN）mRNA表達，誘導TMET發生，進而參與致腎小管間質纖維化的發生發展[10-11]。此外，白蛋白還可能通過促進Ⅳ型膠原（col-Ⅳ）的合成及上調基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）使ECM積聚，進一步參與腎間質纖維化[12]。白蛋白可通過ERK、TGF-β1/Smad、Akt、Notch等信號通路而參與腎纖維化發生發展[13-16]。

早期生長反應因子（Early growth response gene-1，Egr-1）又稱為NFGI-A、Krox24、TIS8等，是一種具有鋅指結構的轉錄因子，是即刻早期基因（immediate early gene）家族成員之一，該家族包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4、c-Jun等 30多種成員[3]。Egr-1在腎臟的腎小球系膜細胞、內皮細胞、腎小管成纖維細胞及上皮細胞均可檢測到表達，誘導表達后可調控包括血小板衍生生長因子（PDGF-C）、細胞間黏附分子-1、TGF-β等一系列基因的表達，參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡以及腫瘤的發生[4-5]。很多學者均認為，Egr-1參與了腎組織纖維化的發生發展[17-20]。TGF-β是公認的致纖維因子，其可通過Smad通路，誘導Egr-1 mRNA和蛋白表達，且表達的TGF-β本身又可作為刺激源激活Egr-1表達，可推測TGF-β可引發Egr-1的促纖維化反應。在UUO模型中，將DNA酶導入成纖維細胞內，可下調TGF-β、α-SMA、FN和Ⅰ型膠原（col-Ⅰ）mRNA表達，抑制肌成纖維細胞形成，起到抗腎間質纖維化的作用[21]。實驗表明，激活細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶（Erk/MPARK）信號途徑可使Egr-1轉入細胞內，導致PDGF-C表達增加，進而促進腎纖維化的發展[22]。此外，Egr-1通過介導細胞凋亡、誘導成纖維細胞生成、細胞外基質聚積等參與腎纖維化，因此Egr-1可能是器官纖維化發病機制中的重要環節[23]。

本實驗采用人血清白蛋白干預HK-2細胞24、48、72 h時，發現各個時間段EGR-1表達均增加，但在40 mg/mL人血清白蛋白刺激時可穩定使EGR-1表達明顯增加，因此推斷人血清白蛋白有可能通過上調Egr-1表達，促進腎間質纖維化。綜上所述，人血清白蛋白在一定范圍內能以劑量和時間依賴方式誘導培養的腎小管上皮細胞誘導Egr-1蛋白表達增加。

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