自噬減輕模擬缺血/再灌注微環境中肺微血管內皮細胞損傷*

張　丹，李　靜，李玉蘋，李翅翅(溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥學科，浙江溫州5000;復旦大學附屬中山醫院呼吸內科，上海000;溫州醫科大學附屬第一醫院整形外科，浙江溫州5000)

自噬減輕模擬缺血/再灌注微環境中肺微血管內皮細胞損傷*

張丹1，李靜2，李玉蘋1，李翅翅3△
(1溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥學科，浙江溫州325000;2復旦大學
附屬中山醫院呼吸內科，上海200032;3溫州醫科大學附屬第一醫院整形外科，浙江溫州325000)

［摘要］目的:觀察體外模擬缺血/再灌注( ischemia/reperfusion，I/R)微環境下人肺微血管內皮細胞( human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)的自噬變化，研究自噬在維持I/R條件下HPMVECs細胞存活及內皮屏障完整性中的作用。方法:用雷帕霉素( rapamycin，RAP)預處理HPMVECs，在缺糖缺氧/恢復糖和氧供( oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose restoration，OGD)模擬的I/R微環境中孵育細胞。應用Western blot及透射電鏡法檢測細胞自噬變化，用流式細胞術檢測細胞凋亡，通透性小室法檢測HPMVECs通透性。結果: OGD條件下HPMVECs的自噬水平明顯升高，RAP預處理進一步上調了OGD條件下的細胞自噬。OGD組細胞凋亡率明顯增高，細胞通透性增加。RAP預處理不僅降低了OGD引起的細胞凋亡率，而且減輕了OGD條件下細胞通透性。結論:自噬在I/R誘發的肺微血管內皮細胞損傷中發揮保護性作用，提高自噬水平有助于減少I/R條件下細胞凋亡并維持內皮屏障完整性。

［關鍵詞］肺微血管內皮細胞;自噬;缺血/再灌注;細胞凋亡;內皮通透性

自噬是亞細胞膜結構發生動態變化并在溶酶體參與下對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程。根據細胞內底物運送到溶酶體的方式不同，可將自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬3種類型［1］。其中巨自噬是真核細胞內最重要的自噬形式，也是本研究的重點。生理狀態下細胞的自噬水平很低，但饑餓、缺血及缺氧等應激刺激可提高細胞自噬水平［2］。研究表明，自噬有助于維持某些病理狀態下細胞的存活，阻斷自噬則加重細胞損傷［3］。缺血/再灌注誘發的肺損傷( ischemia/reperfusion induced lung injury，I/R-LI)是發生于肺移植及心臟手術中的一種嚴重并發癥，主要病理變化為氣血屏障受損繼而引發肺水腫［4］，嚴重影響了患者的心肺功能。肺微血管內皮細胞是氣血屏障的重要組成細胞之一。研究證實，肺微血管內皮細胞死亡和肺微血管屏障完整性受損是I/R-LI過程中氣血屏障功能失調的重要原因［5］。然而，自噬與肺I/R中肺微血管內皮細胞死亡和微血管屏障完整性受損的關系及機制仍不清楚。

雷帕霉素( rapamycin，RAP)是一種臨床上廣泛使用的免疫抑制劑。同時，RAP還是一種自噬促進劑，主要通過特異性抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin，mTOR)復合體1的功能上調細胞自噬水平［6］。眾多研究已發現RAP在多種疾病中發揮的細胞保護性作用源于其對自噬的調節［7-8］。本研究通過用RAP預處理的方法研究了其對體外模擬I/R微環境中肺微血管內皮細胞自噬的影響，并進一步檢測了自噬對細胞死亡及血管屏障完整性的調節作用。

材料和方法

1細胞

原代人肺微血管內皮細胞( human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)購自Sciencell。培養細胞使用特制的內皮細胞培養基。將內皮細胞接種于涂布有I型膠原的培養皿中，3～5 d后細胞生長達到90%以上匯合即可進行傳代，傳代時使用胰酶消化并按1∶2比例進行傳代。本實驗中使用了第3～5代的細胞。

2方法

2.1實驗分組及體外缺血/再灌注微環境模擬按照文獻［9］所描述的缺糖缺氧/恢復糖和氧供( oxygenglucose deprivation/oxygen-glucose restoration，OGD)方法在體外模擬缺血/再灌注微環境。將HPMVECs隨機分為空白對照組( control組)、RAP單純處理組( RAP組)、單純OGD處理組( OGD組)及RAP預處理的OGD組( RAP + OGD組)。RAP + OGD組處理方法如下:將RAP按照10 nmol/L濃度加入細胞培養基中孵育4 h，然后用不含葡萄糖及胎牛血清的培養基更換正常培養基并將培養皿放入37℃無氧培養箱中。8 h后將培養皿取出，用正常含血清培養基更換無糖培養基并將培養皿置入含5% CO2的正常培養箱中孵育12 h。

2.2蛋白印跡法用細胞蛋白裂解液處理HPMVECs后收集細胞上清，然后行15% SDS-PAGE，使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置將凝膠中蛋白轉至PVDF膜上，設定轉膜電流為250 mA，轉膜時間為60 min，加入Western blot封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min，再分別以兔抗微管相關蛋白1輕鏈3 ( microtubule-associated protein 1-light chain 3，LC3)及兔抗p62蛋白Ⅰ抗，以標記有辣根過氧化物酶的羊抗兔Ig為Ⅱ抗孵育PVDF膜。內參照蛋白選用β-actin。使用Thermo的ECL試劑為底物，X光片曝光，顯色、定影。最后通過Quantity One 4.6軟件對發光條帶的灰度值進行分析，通過比較各組LC3-II/LC3-I及p62/β-actin來了解自噬水平。

2.3透射電鏡標本制備及自噬結構斷面積統計在不同處理組的HPMVECs中加入2.5%戊二醛，在4℃條件下預固定2 h。用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。然后用1%鋨酸固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。50%、70%、90%乙醇逐級脫水，各15 min。在4℃條件下，用90%乙醇和90%丙酮混合液( 1∶1)置換乙醇，再用90%丙酮置換，各15 min。然后，在室溫下用純丙酮置換3次，每次20 min。將細胞放入純丙酮和Jpurr樹脂( 2∶1)的混合液中浸透，室溫條件下放置3 h。然后，在純丙酮和Jpurr樹脂( 1∶2)的混合液中過夜。37℃條件下，在Jpurr樹脂中放置2 h。分別于37℃烘箱中過夜、45℃烘箱中放置12 h、60℃烘箱中放置24 h。首先將包埋后的細胞塊于超薄切片機上切取厚度為1.5 mm的半薄切片，將其移到涂有蛋白甘油加水滴的載玻片上，然后于37℃烘箱內烘干。將甲苯胺藍染液( 1 g/L)滴在切片上，5 min后，用洗瓶沖洗切片上多余的染液，濾紙吸干水分，自然干燥。光學顯微鏡下觀察半薄切片確定含有細胞情況，用Reichert-ultracut E型超薄切片機作超薄切片，厚度為50～60 nm。在透射電鏡下觀察細胞胞質內的自噬前體和自噬體等自噬相關結構。用VLCDS圖像分析儀檢測并分析單位細胞斷面面積內的自噬結構數目，比較OGD各組與對照組之間的差異。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡按照BD生產的Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，將刮離培養皿的細胞用冰冷的PBS清洗2次，然后用結合緩沖液將細胞混懸至濃度約1×109/L。將100 μL的細胞混懸液轉移至5 mL特制流式檢測玻璃管中，分別加入5 μL AnnexinV-FITC試劑及5 μL PI染料。充分混懸后置于暗室中于室溫下孵育15 min，然后加入400 μL結合緩沖液并混勻。立即將細胞懸浮液在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

2.5細胞培養小室法檢測細胞通透性預先在Transwell嵌套小室(濾膜直徑為6.5 mm，濾膜孔徑為3 μm)的上室膜上涂以50 μL濃度為50 g/L的I型膠原，將小室置于通風的超凈臺中放置過夜，然后用70%的乙醇浸泡滅菌并風干。將200 μL密度為4. 4×1010cells/m2細胞懸液加入上室，在下室的培養板里加入1 mL培養液，將細胞置于培養箱中培養4 d，在此期間，每24 h更換1次培養液。預先1 h在上室細胞培養基中加入RAP，然后各組進行OGD處理，在OGD開始時在上室中加入FITC標記的葡聚糖使其終濃度為1 g/L。分別于OGD開始時和20 h時吸取100 μL下室的液體到96孔板中，用PBS以1∶5稀釋后，通過熒光酶標儀測量吸光度( A)值，用開始時的A值校正各時點所測值。實驗重復3次，結果以與對照組所測值比值的百分數表示。

3統計學處理

實驗均獨立重復3次，采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行處理，結果用均數±標準差( mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 RAP預處理提高了OGD條件下HPMVECs的自噬水平

與空白對照組細胞相比，RAP預處理增強了正常生長細胞LC3-I向LC3-II的轉化率( P＜0.01)，降低了p62的表達水平( P＜0.01)。OGD處理組細胞的LC3-II表達水平較對照組明顯增加( P＜0.01)，p62的表達水平則顯著降低( P＜0.01)。與OGD處理組相比，RAP預處理增加了OGD條件下LC3-I向LC3-II的轉換( P＜0.05)，降低了p62的表達( P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The autophagic level in oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose restoration ( OGD) -challenged human pulmonary microvascular endothelial cells ( HPMVECs) with rapamycin ( RAP) preconditioning.Mean±SD.n =3.##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖1　Western blot方法檢測細胞自噬水平

2 RAP預處理對OGD條件下HPMVECs自噬超微結構的影響

本實驗中，我們觀察到自噬前體呈馬蹄形樣雙層膜結構，其不完全包裹細胞質樣物質，自噬體呈多層膜包裹的橢圓形結構，其包裹物為類似胞質樣的均質物質。自噬溶酶體則為單層膜結構，其中包裹有自噬體樣橢圓形結構。統計分析表明，與對照組相比，單純RAP處理組及OGD處理組細胞單位斷面面積內自噬相關超微結構的數目顯著增大( P＜0. 01)，而RAP預處理繼而OGD處理組細胞中此參數較單純OGD組進一步增高( P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Autophagic ultrastructures and statistical analysis by transmission electron microscopic observation.A: the autophagosome precursors (↑) was as crescentiform and double membrane structure; B: the autophagosome coating multi-membrane(↑) ; the contents of the autophagosome may be cytoplasm; C: the autophagolysosome was a structure with single membrane and contain an autophagosome (↑) ; D: quantitative analysis of the number of autophagosomes in different groups.Mean±SD.n =3.##P＜0. 01 vs control group;＊＊P＜0. 01 vs OGD group.圖2　自噬超微結構圖像及統計分析

3 提高自噬水平改善了OGD引發的細胞死亡

如圖3所示，空白對照組細胞的凋亡率為( 4.83 ±1.13) %，單純RAP處理組細胞凋亡率約( 4.79 ±1.11) %，兩者無明顯統計學差異。OGD組細胞凋亡率較對照組明顯升高，達( 26.30±1.62) %，而用RAP預處理則顯著降低了OGD引發的細胞凋亡，凋亡率僅為( 14.6±1.7) %( P＜0.05)。

4 提高自噬水平對OGD條件下HPMVECs通透性的影響

對照組細胞通透性較低，我們將空白對照組細胞通透性作為基數來檢測其它處理組細胞通透性。與空白對照組相比，RAP處理組細胞通透性未發生明顯改變，而OGD處理組細胞通透性較對照組明顯升高( P＜0.01)。與OGD組相比，RAP預處理繼而OGD處理組細胞通透性顯著降低( P＜0.05)，見圖4。

討論

本實驗檢測了OGD條件下HPMVECs的自噬變化并研究了自噬對OGD微環境下HPMVECs凋亡及通透性等的影響。我們觀察到，與對照組相比，OGD條件下HPMVECs的自噬水平升高，細胞凋亡率及內皮通透性均明顯升高。預先用RAP提高自噬水平后，明顯降低了OGD誘發的細胞凋亡率，并且有效改善了內皮屏障的高通透性。本文提出，自噬不但有利于維持OGD條件下細胞存活，并且有助于維持內皮細胞屏障的完整性。

Figure 3.The effects of autophagy on the apoptosis of OGD-challenged HPMVECs.Mean±SD.n = 3.#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖3　自噬對OGD條件下HPMVECs凋亡的影響

Figure 4.The effect of autophagy on the permeability of HPMVECs challenged by OGD.Promoting autophagy with RAP alleviated OGD-induced high permeability in HPMVECs.Mean±SD.n = 3.#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control group;*P＜0. 05 vs OGD group.圖4　自噬對OGD條件下HPMVECs通透性的影響

多種蛋白參與了細胞自噬過程，其中，LC3是參與自噬體形成的必須蛋白，自噬體形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，轉變為自噬體膜型LC3-II，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。p62是自噬酶解底物，其表達水平與自噬水平呈負相關［10］。在本實驗中，我們一方面檢測了LC3及p62的表達變化，另外通過透射電鏡觀察并分析了細胞內自噬超微結構數量，由此來更加客觀評價不同處理組細胞的自噬水平。我們觀察到，OGD條件下，自噬水平明顯增高，RAP預處理進一步提高了細胞在OGD條件下的自噬水平。同樣，Matsui等［11］發現用無糖培養基處理明顯上調了心肌細胞的自噬水平。Wang等［12］也觀察到缺糖缺氧處理后的神經元細胞自噬水平明顯高于對照組。但是，過長時間的缺血缺氧可損傷自噬-溶酶體途徑，大量自噬體的積聚引起心肌細胞不可逆的損傷和心肌收縮功能障礙［13］。研究認為，在長期缺氧條件下，缺氧誘導因子1可通過抑制自噬基因Beclin-1的表達而由此阻斷自噬體形成［14］。這些不同的研究結果反映了體外模擬的I/R微環境對細胞自噬水平發揮重要影響，不同刺激時間以及刺激方式可能對自噬發揮不同程度的影響。這些研究也提示體外模擬的I/R微環境不能完全模擬在體I/R損傷，所以無法充分說明自噬在I/ R-LI中的作用。未來的研究將重點靶向闡明I/R微環境下多種損傷因素對自噬的具體調節機制。

在I/R-LI中，肺微血管內皮細胞是主要損傷靶點之一。I/R過程中產生的超氧化物不僅引發細胞損傷而且容易誘發細胞凋亡或壞死，導致氣血屏障受損致使肺水腫發生。我們的研究表明，適度自噬有利于維持OGD條件下的細胞存活及肺微血管內皮細胞屏障完整性。預先用RAP提高細胞自噬水平明顯降低了OGD引發的細胞損傷及高通透性。這些結果與自噬特有的功能是相符合的。首先，自噬可以包裹受損的線粒體，由此減少了損傷線粒體內諸如細胞色素C等一系列促凋亡因子的釋放，從而抑制了凋亡的啟動［15］。另一方面，在饑餓等應激狀態下，細胞可通過自噬降解自身的一些損傷細胞器或長壽蛋白質，由此為其自身存活提供了新陳代謝所必需的氨基酸等小分子物質，而且有助于維持三羧酸循環并為細胞提供ATP［16］。這些過程對于肺微血管內皮細胞在I/R環境下的存活及細胞間緊密連接的形成都是必不可少的。這些證據都合理解釋了適度自噬在OGD條件下內皮細胞存活及屏障完整性維持中的作用。

綜上所述，本研究明確了自噬有助于維持肺微血管內皮細胞在I/R條件下的存活，并且在維持內皮屏障完整性中發揮保護性作用。RAP預處理上調自噬進一步增強了自噬對HPMVECs的保護性作用。我們的研究為進一步闡明I/R-LI的機制提供了實驗依據，并且自噬有望作為未來治療I/R-LI相關疾病的新的干預靶點。

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Autophagy attenuates injury of human pulmonary microvascular endothelial cells under mimic ischemia/reperfusion microenvironment

ZHANG Dan1，LI Jing2，LI Yu-ping1，LI Chi-chi3
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Respiratory Medicine，Zhongshan Hospital Fudan University，Shanghai 200032，China;3Department of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，Chin.E-mail: lichichi2008@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To detect the autophagic changes of human pulmonary microvascular endothelial cells ( HPMVECs) under ischemia/reperfusion ( I/R) microenvironment，and to clarify the effects of autophagy on the HPMVECs survival and endothelial barrier integrity under I/R condition.METHODS: Rapamycin ( RAP) was applied to promote autophagy of HPMVECs.These cells were then incubated under the condition of oxygen-glucose deprivation/oxygenglucose restoration ( OGD).After exposure to OGD，the changes of autophagy，cellular death and permeability of the cells were determined by transmission electron microscopy，flow cytometry and transwell assay，respectively.RESULTS: Compared with the control cells，OGD-challenged cells had a much higher level of autophagy.The apoptotic rate was much higher and endothelial permeability was more serious in OGD group than those in control group.Preconditioning with RAP effectively improved OGD induced autophagy，it did not affect the cell survival and endothelial permeability under normal living condition，but obviously decreased the cells apoptotic rate，and remarkably lowered OGD-induced high permeability of the cells.CONCLUSION: Autophagy protects HPMVECs against I/R-induced injury.Promotion of autophagy is helpful for attenuating I/R-induced cell death and sustaining the endothelial barrier integrity.

［KEY WORDS］Pulmonary microvascular endothelial cells; Autophagy; Ischemia/reperfusion; Apoptosis; Endothelial permeability

通訊作者△Tel: 0577-88069280; E-mail: lichichi2008@163.com

*［基金項目］浙江省自然科學基金青年基金資助項目( No.LQ15H150002)

［收稿日期］2014-12-25［修回日期］2015-05-05

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1253-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.018