DEK表達下調通過抑制胃癌SGC-7901細胞中NF-κB信號途徑誘導細胞凋亡*

張彩鳳，董良鵬，夏永華，郭曉鶴，張利利，周慧聰，張蘭芳，李貞娟，韓　宇(新鄉醫學院第一附屬醫院消化內科，普通外科，皮膚科，河南衛輝4500)

DEK表達下調通過抑制胃癌SGC-7901細胞中NF-κB信號途徑誘導細胞凋亡*

張彩鳳1△，董良鵬2，夏永華3，郭曉鶴1，張利利1，周慧聰1，張蘭芳1，李貞娟1，韓宇1
(新鄉醫學院第一附屬醫院1消化內科，2普通外科，3皮膚科，河南衛輝453100)

［摘要］目的:研究DEK表達下調對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響，并分析其與NF-κB信號途徑及凋亡相關蛋白表達的關系。方法:將DEK siRNA和對照siRNA轉染胃癌SGC-7901細胞，并將SGC-7901細胞分為未處理組、對照siRNA組及DEK siRNA組。采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測3組胃癌SGC-7901細胞中DEK mRNA和蛋白的表達;流式細胞術檢測3組SGC-7901細胞凋亡的變化; Caspase-Glo-3/9試劑盒檢測3組SGC-7901細胞中caspase-3和caspase-9的活性; Western blot技術檢測3組SGC-7901細胞中NF-κB信號途徑關鍵調控蛋白p65及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達。結果:與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組SGC-7901細胞中DEK的mRNA和蛋白表達水平顯著下調( P＜0.05)。DEK siRNA組SGC-7901細胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著高于未處理組和對照siRNA組( P＜0.05)。最為顯著的是，DEK siRNA轉染細胞后，p65和Bcl-2蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調，并伴隨caspase-3和caspase-9活性上升。結論: DEK表達下調介導的SGC-7901細胞凋亡可能與NF-κB信號途徑密切相關。

［關鍵詞］胃癌; DEK;細胞凋亡; NF-κB信號途徑

胃癌發病率在全球范圍內居第4位，其死亡率為惡性腫瘤死亡率的第2位［1-3］。盡管胃癌的手術及化療方案有很大的改善［4-5］，胃癌仍保持較高的致死率和較低的存活率［6］。目前，腫瘤分子靶向治療可能成為繼手術、放療和化療之后的新的替代手段，因此，尋找新的分子靶點治療胃癌具有十分重要的意義。

DEK基因定位于染色體6p，最初在急性髓系白血病染色體轉位t( 6; 9) ( p23; q34)中的靶點被發現［7］。隨著分子腫瘤學的快速發展，對于DEK功能的闡明也逐漸明晰，研究顯示，DEK作為染色質構建蛋白，在mRNA的剪接、轉錄控制、DNA損傷修復、分化、細胞存活、細胞凋亡、信號轉導以及化療抗性中發揮極其重要的作用［8-11］。進一步研究表明，DEK在多種不同的腫瘤中呈現過表達，其與腫瘤的發生發展及預后關系密切［12-16］。此外，DEK在胃癌組織中的表達水平也顯著高于胃黏膜異型增生組織和正常組織［17］，提示DEK可能在胃癌的發生發展中發揮癌基因的作用，但其分子機制尚需探討。本研究中，我們利用DEK特異性的siRNA下調胃癌SGC-7901細胞中DEK mRNA和蛋白的表達，研究DEK表達下調對胃癌細胞凋亡的影響，并分析其對NF-κB信號途徑關鍵調控蛋白p65的表達、凋亡相關蛋白caspase-3和caspase-9的活性以及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，初步探討其介導凋亡可能的分子機制，該研究有望為以DEK為分子靶點的胃癌基因治療提供新的實驗證據。

材料和方法

1細胞株和實驗材料

胃癌SGC-7901細胞株購自中科院上海細胞研究所。RPMI-1640培養基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自Gibco;脂質體2000購自Invitrogen; TRIzol購自Invitrogen;一步法實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司;蛋白裂解液購自TaKaRa;凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC Kit購自BD; Caspase-Glo-3/9試劑盒購自Promega; DEK、p65、Bcl-2、Bax 和β-actin抗體以及DEK siRNA和對照siRNA( control siRNA)均購自Santa Cruz。

2方法

2.1細胞培養和siRNA轉染將胃癌SGC-7901細胞株從液氮中取出，置于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養液中復蘇，傳3代后，當細胞融合度達90%左右時，按照脂質體2000的說明書將DEK siRNA和對照siRNA轉染胃癌SGC-7901細胞。在后續實驗中將細胞分為未處理組(培養的SGC-7901細胞不進行任何處理)，對照siRNA組(將對照siRNA轉染SGC-7901細胞)和DEK siRNA組(將DEK siRNA轉染SGC-7901細胞)。

2.2流式細胞術檢測不同組別的SGC-7901細胞凋亡將DEK siRNA轉染后于48 h收獲細胞，采用預冷PBS緩沖液漂洗，按1×109/L密度重懸細胞，接著取100 μL細胞置于流式管中，加入Annexin VFITC和PI各5 μL，于避光下孵育15 min后采用流式細胞術檢測10 000個細胞，最后采用Cell Quest軟件分析細胞凋亡的結果。

2.3不同組別的SGC-7901細胞中caspase-3和caspase-9的活性分析按照Caspase-Glo-3/9試劑盒說明書檢測caspase-3和caspase-9的活性，其步驟如下: DEK siRNA和對照siRNA轉染后于48 h收獲細胞，并置于緩沖液( 25 mmol/L Hepes，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L Pefabloc和胃酶抑素、亮肽素和抑肽酶各1 mg/L)，充分懸浮后，于4℃13 000 r/min離心15 min。將澄清的提取液中的蛋白濃度預先調整為1 g/L，－80℃下凍存。為了測定caspase活性，將稀釋后的提取液( 10 mg/ L)與Caspase-Glo檢測試劑等體積混合，置于96孔白壁培養板中。室溫孵育1 h，然后使用讀板的發光檢測儀讀數。

2.4實時熒光定量PCR檢測不同組別的SGC-7901細胞中DEK mRNA的表達收集轉染后48 h的3組胃癌SGC-7901細胞，采用TRIzol試劑分別提取各組不同處理的SGC-7901細胞的總RNA，設計DEK的上游引物為5’-CCAGGCACTGTGTCCTCATT-3’，下游引物為5’-GGCAATGGTTTGCCAGAAGG-3’，產物大小為233 bp;內參照β-actin的上游引物為5’-GTCACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物為5’-TAGCAACGTACATGGCTGGG-3’，產物大小為181 bp。然后按一步法實時熒光定量PCR試劑盒的操作說明配制反應體系，于ABI 7300儀器上進行PCR反應，反應程序為反轉錄反應50℃30 min。PCR條件: 94℃2 min; 94℃30 s，56℃30 s，65℃延伸30s，35個循環。實驗中每個樣品重復3次，基因的相對表達分析采用2－ΔΔCt方法進行計算［18］。

2.5Western blot檢測蛋白表達收集轉染后48 h 的3組不同處理的胃癌SGC-7901細胞，提取總蛋白并行SDS-PAGE，接著取下凝膠并電轉移至NC膜上。然后采用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉NC膜2 h，加入Ⅰ抗( DEK、p65、Bcl-2、Bax和β-actin，1∶200)，于4℃搖床中過夜孵育。次日加入Ⅱ抗于室溫孵育2 h。將NC膜置于增強化學發光試劑中反應1～3 min，于暗室中采用X射線曝光，常規方法進行顯影、定影，顯示特異的蛋白信號。蛋白表達的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，蛋白相對表達水平為目的基因的灰度值與內參照基因的灰度值的比值，其中β-actin作為內參照。

3統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對上述實驗結果進行統計分析，數據以均數±標準差( mean±SD)表示，3組之間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1 DEK siRNA顯著下調胃癌SGC7901細胞中DEK mRNA的表達

將DEK siRNA轉染SGC-7901細胞后48 h，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中DEK mRNA的表達顯著下調，且差異有統計學意義( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中DEK mRNA的表達無差異，見圖1。

Figure 1.DEK siRNA inhibited the mRNA expression of DEK in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖1　DEK siRNA抑制胃癌SGC-7901細胞中DEK mRNA的表達

2 DEK siRNA顯著下調胃癌SGC-7901細胞中DEK蛋白的表達

將DEK siRNA轉染SGC-7901細胞后48 h，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中DEK蛋白的表達顯著下調( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中DEK蛋白的表達無統計學差異，見圖2。

3 DEK表達下調對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中胃癌SGC-7901細胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著上升( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中SGC-7901細胞的凋亡率無統計學差異，見圖3。

Figure 2.DEK siRNA inhibited the protein expression of DEK in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖2　DEK siRNA抑制胃癌SGC-7901細胞中DEK蛋白的表達

4 DEK表達下調抑制胃癌SGC-7901細胞中p65的表達

為了進一步探討DEK表達下調誘導細胞凋亡的分子機制，用Western blot檢測轉染前后NF-κB信號途徑中的關鍵蛋白p65的表達。結果表明，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中SGC-7901細胞中p65蛋白的表達顯著下調( P＜0. 05)，而未處理組和對照siRNA組之間p65蛋白的表達無統計學差異，見圖4，這些結果表明DEK表達下調能顯著抑制胃癌細胞中NF-κB信號途徑。

5 3組胃癌SGC-7901細胞中caspase-3和caspase-9的活性分析

Figure 4.The effect of DEK downregulation on NF-κB signaling pathway in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean± SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖4　DEK表達下調對胃癌SGC-7901細胞中NF-κB信號途徑的影響

6 DEK表達下調對胃癌SGC-7901細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

為了進一步分析DEK表達下調誘導細胞凋亡的可能的分子機制，我們又采用Westernblot分析轉染前后細胞凋亡關鍵蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表達。結果顯示，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白表達顯著下調，而Bax蛋白的表達顯著上調( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組之間Bcl-2和Bax蛋白的表達無顯著差異，見圖5。

表1　3組胃癌SGC-7901細胞的caspase-3和caspase-9活性分析Table 1.The activities of caspase-3 and caspase-9 in the SGC-7901 cells with different treatments ( Mean±SD.n = 3)

討論

DEK作為高度保守的核基因，優先表達在增殖活躍的細胞和惡性腫瘤中，其在每個核中大概有4～5百萬個拷貝［19］。DEK已經被證實能促進多種不同類型的腫瘤發生，這可能是由于其能抑制細胞的分化、衰老和凋亡［11］，因而抑制DEK的表達有望成為腫瘤治療的潛在分子靶點。為了分析DEK在胃癌中的功能，我們首先將DEK siRNA轉染胃癌SGC-7901細胞，采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測轉染前后DEK mRNA和蛋白的表達，我們發現DEK siRNA轉染后的48 h，胃癌SGC-7901細胞中DEK mRNA和蛋白的表達明顯低于未處理組和對照siRNA組，提示DEK siRNA能顯著下調胃癌細胞中DEK mRNA和蛋白的表達，這一結果為后續進一步闡明DEK的功能提供了極其理想的研究平臺。

Figure 5.The effect of DEK downregulation on the protein expression of Bcl-2 and Bax in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖5　DEK表達下調對胃癌SGC-7901細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

腫瘤細胞最為顯著的特征之一是逃避細胞凋亡［20］，因而誘導細胞凋亡可能成為腫瘤治療的新的策略和手段。研究表明，在宮頸癌HeLa細胞中敲除DEK能誘導細胞凋亡，這可能至少部分通過腫瘤抑制基因p53的誘導實現［21］。此外，DEK新的凋亡功能在轉錄控制的抗凋亡蛋白MCL-1中被鑒定［8］。Liu等［22］研究表明，沉默DEK的表達能誘導宮頸癌CaSki細胞的凋亡和衰老，這可能主要通過抑制NF-κB信號途徑實現。最為重要的是，Kim等［23］利用質譜分析DEK的作用靶點時，發現DEK能調控58個下游靶蛋白，其中包括41個上調基因和17個下調基因，最后對58個蛋白進行鑒定，發現16%的蛋白與凋亡相關。這些研究表明DEK可能在調控腫瘤細胞凋亡中發揮極其關鍵的作用，在本研究中，為了闡明是否DEK表達下調能引起胃癌細胞發生凋亡，我們采用流式細胞術分析不同處理的胃癌細胞凋亡的變化，結果發現，DEK siRNA組中胃癌SGC-7901細胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著高于未處理組和對照siRNA組，提示DEK表達下調能明顯誘導胃癌細胞發生凋亡。

研究表明，調控NF-κB信號途徑可以誘導SGC-7901細胞的凋亡［24］，因而可能成為潛在的分子治療靶點［25］。激活的NF-κB信號途徑在胃癌SGC-7901細胞中主要表現為抗凋亡作用，其分子機制是通過直接調控下游靶基因的表達，如通過調節Bcl-2家族蛋白來發揮抗凋亡作用［26］。此外，caspases的活化是細胞程序性死亡的終末期，該過程能被Bcl-2家族成員所抑制［27］，可以通過激活caspases的活性切割作用而誘導SGC-7901細胞發生凋亡現象［28］。研究顯示，抑制DEK的表達能通過抑制NF-κB信號途徑來誘導細胞凋亡［22］。為了進一步分析DEK表達下調誘導凋亡的分子機制，我們采用Western blot技術檢測不同處理的胃癌SGC-7901細胞中NF-κB信號途徑的關鍵組分p65蛋白以及凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax的表達，并分析caspase-3和caspase-9的活性，我們發現，DEK表達下調能顯著降低胃癌細胞中p65蛋白的表達，提示DEK表達下調能抑制胃癌細胞中NF-κB信號途徑。進一步的研究顯示，DEK表達下調能顯著增加caspase-3和caspase-9的活性，提高Bax的表達和降低Bcl-2的表達。這些結果提示DEK表達下調介導的胃癌細胞凋亡與NF-κB信號途徑的抑制或失活密切相關，并與凋亡相關蛋白的活性或表達變化密切相關。

總之，我們的結果顯示，DEK siRNA能顯著下調胃癌細胞中DEK mRNA和蛋白的表達，其表達下調能誘導胃癌細胞凋亡，這與NF-κB信號途徑的抑制密切相關，并使得caspase-3和caspase-9的活性以及Bax的表達升高和Bcl-2的表達降低，從而導致胃癌細胞凋亡的發生，因此，DEK可能成為新的胃癌治療的分子靶點。

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Downregulation of DEK induces cell apoptosis via inhibition of NF-κB signaling pathway in gastric carcinoma SGC-7901 cells

ZHANG Cai-feng1，DONG Liang-peng2，XIA Yong-hua3，GUO Xiao-he1，ZHANG Li-li1，ZHOU Hui-cong1，ZHANG Lan-fang1，LI Zhen-juan1，HAN Yu1
(1Department of Gastroenterology，2Department of General Surgery，3Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Weihui 453100，China.E-mail: zhangcaifeng666@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of DEK downregulation on the apoptosis of gastric carcinoma SGC-7901 cells，and to explore its associations with NF-κB signaling pathway and apoptosis related proteins.METHODS: SGC-7901 cells with different treatments were divided into 3 groups including untreated group，control siRNA group and DEK siRNA group.The expression of DEK at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells was detected by real-time PCR and Western blot.The cell apoptosis was examined by flow cytometry.Furthermore，the activities of caspase-3 and caspase-9 in the SGC-7901 cells were investigated by Caspase-Glo-3/9 kit.Finally，the expression of key regulatory protein p65 of NF-κB signaling pathway and apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in the SGC-7901 cells was investigated by Western blot.RESULTS: Compared with untreated group and control siRNA group，the expression of DEK at mRNA and protein levels was significantly downregulated in DEK siRNA group ( P＜0.05).In addition，the ratios of early phase apoptosis and total apoptosis in DEK siRNA group were markedly higher than those in untreated group and control siRNA group ( P＜0.05).Most notably，the decrease in p65 and Bcl-2 proteins，increase in Bax protein and the increases of caspase-3 and caspase-9 activities were observed in DEK siRNA group.CONCLUSION: Downregulation of DEK mediates cell apoptosis of gastric carcinoma may be tightly associated with NF-κB signaling pathway.

［KEY WORDS］Gastric carcinoma; DEK; Apoptosis; NF-κB signaling pathway

通訊作者△Tel: 0373-4402216; E-mail: zhangcaifeng666@163.com

*［基金項目］河南省教育廳科技攻關項目( No.2009B320008) ;河南省衛生廳科技攻關項目( No.200804055) ;新鄉醫學院科研培育基金( No.2013QN128)

［收稿日期］2014-12-29［修回日期］2015-05-19

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1197-06

［中圖分類號］R730. 23; R735. 2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.008