葛根素對2型糖尿病大鼠胃血管病變影響及與胃動力的關系?

李維辛，周 蕓，孫曉瑋，王 芳，嚴 祥

(1.蘭州大學第一醫院，蘭州 730000;2.蘭州大學基礎醫學院，蘭州 730000)

葛根素對2型糖尿病大鼠胃血管病變影響及與胃動力的關系?

李維辛1，周 蕓1，孫曉瑋2，王 芳1，嚴 祥1

(1.蘭州大學第一醫院，蘭州 730000;2.蘭州大學基礎醫學院，蘭州 730000)

目的:觀察葛根素對早期2型糖尿病(T2DM)大鼠胃血管病變的影響及與胃動力的關系。方法:制備T2DM大鼠模型按隨機數字表法分為正常對照組(NC組)、葛根素干預正常組(NP組)、糖尿病對照組(DC組)、葛根素干預糖尿病組(DP組)。5周后測定各組胃半排時間(TIME 1/2)、胃排空速率(RATE)、血可溶性內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)、胃一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。檢測胃內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表達，觀察電鏡下胃微血管超微結構改變。結果:與NC組比較，DC組血sEPCR、胃MDA升高，胃SOD、NO、eNOS及CD34表達下降，TIME 1/2縮短、RATE加快，胃微血管超微結構受損。而與DC組比較，DP組的這些指標呈相反變化，相關分析顯示與TIME 1/2最相關的是eNOS。結論:葛根素可以改善早期2型糖尿病大鼠的胃動力異常、胃微血管損傷以及胃組織氧化應激，胃血管內皮損傷可能是胃動力障礙的始動因素。

葛根素;2型糖尿病;胃動力;胃血管病變;動物模型

研究表明，胃腸道在2型糖尿病的發生發展中具有重要作用，已成為糖尿病治療的新靶標［1］。糖尿病患者中檢出胃腸動力紊亂者可達90%以上，并可累及全胃腸道，其中胃動力障礙最為常見［2］。糖尿病胃動力障礙的確切發病機制尚未闡明。血管病變是糖尿病多種并發癥的基礎，內皮細胞損傷是糖尿病血管病變的基礎［3］。橫斷面研究顯示，在1型糖尿病病人［4］和2型糖尿病病人［5］中，冠狀動脈和外周動脈內皮依賴性的血管舒張是下降的。而胃腸道血管內皮是否也有此相似的改變?胃血管結構和功能的完整性是保障胃血液正常供應的決定因素，而胃的血流又是胃動力的重要保障。因此，本研究探討中藥單體葛根素對早期2型糖尿病大鼠胃血管病變的作用機制以及與胃動力的關系，以期為中藥單體臨床治療2型糖尿病胃動力障礙提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠36只，體質量170～200 g，由甘肅省中醫學院實驗動物中心提供，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間10/ 14 h(動物質量合格證編號SCXK(甘)2011-0001-0001346，動物設施使用合格證號SYXK(甘)2011-0001)。

1.2 藥物

葛根素購自西安天本生物工程有限公司(批號TBP100430)，經HPLC檢測純度98.5%。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素(STZ)及多聚賴氨酸購自美國Sigma公司，99mTcDTPA購自上海欣科公司;可溶性內皮細胞蛋白 C受體(sEPCR)試劑盒購自美國R＆D公司;CD34一抗購自美國CST公司;eNOS一抗購自美國bioworld公司;SP-9002試劑盒購自美國Zymed公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及雙縮脲法總蛋白定量測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

針孔型探頭單光子發射計算機斷層照相儀(SPECT，以色列 Elscint Helix)，日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11及 CX21光學顯微鏡，日本 JEM-1230型投射電鏡，美國 Media Cybernetics公司(Image-Pro Plus 6.0)多功能真彩色細胞圖像分析管理系統、美國Awareness科技有限公司STAT FAX 2100全自動酶標儀、德國萊卡RM2015切片機。

1.5 方法

1.5.1 模型制作與分組 將大鼠按隨機數字表法分為正常飼料組(n=16)和高脂飼料組(n= 20)，分別給予普通飼料和高脂飼料(普通飼料添加10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鹽)。喂養8周后，給予高脂組大鼠左下腹腔分2次注射STZ，STZ按1%比例以檸檬酸緩沖液稀釋(pH4.4，冰上配制，現配現用)，第1次注射劑量為30 mg/kg，間隔3 d后第2次注射20 mg/kg;正常組大鼠注射相同體積的pH4.4、0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液。于第2次注射后72 h及1周時取尾靜脈血，用樂生eB-G型虹吸式血糖儀檢測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L，且伴有明顯的多飲、多尿、多食、體質量下降的大鼠，確定為糖尿病造模成功，共16只大鼠成模。將正常及糖尿病模型大鼠分為正常對照組(NC組)、葛根素干預正常組(NP組)、糖尿病對照組(DC組)、葛根素干預糖尿病組(DP組)，隨機給各組分配8只進行試驗。NP及DP組給予葛根素400 mg/kg，每日1次灌胃(PBS緩沖液配制)，各組灌胃劑量為10 ml/kg·d;NC及DC組每日灌胃等體積的PBS緩沖液。藥物干預共5周，每周稱體質量1次，根據體質量變化調整給藥量。

1.5.2 核素胃排空檢查 藥物干預結束后，大鼠禁食不禁水16 h，應用含有同位素(99mTcDTPA)標記的半固體食物1 mL(由1 mL純牛奶與0.5 g面粉配制成糊劑)，通過灌胃器緩慢注入胃內之后立即將大鼠仰臥綁縛于特制固定架上，在SPECT上以大鼠腹部為目標區，窗寬20%，矩陣128×128，放大倍數×3.0，以目標區作為感興趣區行放射性活性采集，前30 min每5 min采集1次，然后每15 min采集1次，連續測定60 min。通過SPECT自帶軟件，計算出胃半排時間(TIME 1/2)及排空速率(RATE)的校正值。

1.5.3 血清學指標測定 大鼠完成胃排空檢查、乙醚吸入麻醉處死后，心臟采血3～6 mL，普通管3000 r/min離心15 min，取血清-20℃保存，酶法檢測血清可溶性內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)水平。

1.5.4 胃組織勻漿指標測定 取全胃沿大彎剪開，用冷生理鹽水漂洗除去血液濾紙拭干。剪取約1/2的腺胃，加入冷勻漿介質(PH7.4，0.01 mol/ LTris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的氯化鈉溶液)，用勻漿器將標本勻漿化制備成10%的懸液，再在0℃的離心機里以3000 r/ min左右離心20 min。上清液在估計蛋白含量后用來估計丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)等指標。胃組織勻漿總蛋白質含量用雙縮脲法測定。MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法，含量用nmol/mg/protein表示;SOD測定采用改良的黃嘌呤氧化酶法，結果以亞硝酸鹽單位U/mg/ protein表示;以硝酸還原酶法檢測NO含量，結果以umol/L表示。

1.5.5 免疫組織化學方法 檢測胃組織內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表達 取胃竇部組織塊(0.5 cm×0.5 cm)置于10%中性緩沖甲醛中固定，常規脫水、石蠟包埋，免疫組織化學染色。包埋后切片、脫蠟，微波修復抗原，滴加兔抗鼠多克隆抗體(一抗最終濃度eNOS-1∶400、CD34-1∶300)及二抗，DAB顯色;充分水洗、蘇木素復染，用PBS緩沖液分別代替一抗作為陰性對照。高倍鏡下觀察胃黏膜eNOS及CD34表達情況，應用Image-proplus多媒體圖像分析儀測定eNOS陽性表達的平均光密度值(eNOS-OD值)，以及胃黏膜CD34免疫組化陽性染色面積百分比(CD34-%)。

1.5.6 電鏡檢測胃黏膜微血管超微結構 取胃竇組織塊置于3%戊二醛中前固定24 h，1/15M磷酸緩沖液漂洗2次，1%四氧化鋨后固定1 h，再經漂洗、梯度脫水。100%丙酮:環氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合固化后，切取60～80 nm超薄切片，再經醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后觀察拍照分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示，非正態數據進行對數轉換，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，計量數據間相關關系采用多因素逐步回歸分析，雙側 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較

表1顯示，DC組大鼠與NC組比較，TIME 1/2縮短，RATE加快(P＜0.05)。DP組大鼠與DC組比較，TIME 1/2加長，RATE減慢(P＜0.05)。NP組大鼠與NC組各指標比較差異無統計學意義。

2.2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD的變化比較

表2顯示，DC組與NC組比較，胃組織MDA(P＜0.01)含量升高，SOD(P＜0.05)水平下降，NO(P＜0.05)水平下降，血sEPCR濃度增加(P＜0.01)。 DP組與DC組比較，MDA(P＜0.05)濃度降低，SOD (P＜0.01)水平增加，NO(P＜0.05)水平增加，sEPCR濃度減低(P＜0.01)。NP組大鼠與NC組各指標比較差異無統計學意義。

表1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較(±s)

表1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05;與DC組比較#P＜0.05

組 別 鼠數 Lg［TIME 1/2］(min) Lg［RATE］(%，min) NC 8 1.66±0.07 0.04±0.07 NP 8 1.76±0.06 -0.06±0.06 DC 8 1.47±0.06* 0.23±0.06*DP 8 1.67±0.07# 0.03±0.07#

表2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD變化比較(±s)

表2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與DC組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 鼠數 MDA(nmol/ml) SOD(U/mgprot) NO(umol/L) sEPCR(Ug/L) NC 8 2.41±0.10 40.16±1.18 34.66±1.42 117.31±3.12 NP 8 2.40±0.07 39.58±1.50 34.50±1.99 119.71±2.41 DC 8 2.83±0.10＊＊ 36.06±1.51* 30.50±0.77* 129.39±1.93＊＊DP 8 2.49±0.12# 43.50±1.06## 34.74±1.11# 119.74±1.50##

2.3 各組大鼠以CD34標記的胃微血管密度及胃微血管eNOS表達的變化比較

表3顯示，DC組大鼠與NC組比較，CD34-%及eNOS-OD下降(P＜0.05);DP組大鼠與DC組比較，CD34-%及 eNOS-OD增加(P＜0.01和 P＜0.05);NP組大鼠與NC組比較差異無統計學意義。

表3 各組大鼠CD34-%、eNOS-OD的變化比較(±s)

表3 各組大鼠CD34-%、eNOS-OD的變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05;與DC組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 鼠數 CD34(%)eNOS-OD NC 8 0.30±0.04 0.61±0.07 NP 8 0.37±0.09 0.53±0.04 DC 8 0.20±0.06* 0.36±0.07*DP 8 0.34±0.07## 0.54±0.05#

2.4 各組大鼠胃微血管超微結構的變化

NC組大鼠微血管管腔規則，內皮細胞無腫脹，基底膜為連續完整的電子密度均勻的膜性結構，基底膜結構清楚，環繞內皮細胞。內皮細胞內的異染色質分布均勻，線粒體、內質網及高爾基體等細胞器形態正常。DC組大鼠的微血管管腔變性、狹窄，內皮細胞腫脹，基底膜電子密度不均，連續性及完整性破壞且結構模糊。內皮細胞內異染色質聚集、靠邊，線粒體腫脹、嵴變短、消失，部分發生髓鞘樣變，甚至結構模糊不清。DP組大鼠的大多數微血管基底膜結構明顯，較DC組的清晰并呈連續完整的膜性結構，線粒體無腫脹、擴張，嵴正常，存在雙層膜結構，未見異染色質聚集現象。NP組大鼠的微血管電鏡下結構正常，同NC組表現(如圖1)。

2.5 相關分析

以TIME 1/2為因變量(Y)，以NO(X1)、sEPCR (X2)、MDA(X3)、SOD(X4)、CD34(X5)和eNOS-OD (X6)為自變量進行多因素逐步回歸分析，結果顯示相關因素為eNOS-OD(F=8.372，P=0.01)，回歸方程:Y=0.694 X6+1.268。

圖1 各組大鼠胃黏膜層內皮細胞電鏡下結構

3 討論

目前的研究認為，糖尿病多臟器損害的病理基礎是大血管和微血管病變，內皮功能障礙被認為是糖尿病血管疾病發病的一個重要因素［3］。NO是主要的內皮源性舒張血管物質，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)是其合成的關鍵酶。內皮細胞蛋白C受體(EPCR)特異性表達于血管內皮細胞的管腔面，參與蛋白 C的抗凝抗炎等途徑［6］。病理狀態下，EPCR可從血管內皮細胞脫落形成 sEPCR［7］。Brownlee曾指出，高血糖引發的氧化應激對血管內皮細胞損傷是糖尿病并發癥發生機制中關鍵性的第一步［8］。脂類［9］和葡萄糖［10］負荷均與活性氧(ROS)的增加有關。ROS能增加脂質過氧化反應終產物丙二醛(MDA)產生，干擾eNOS的活化，使NO失活，降低血管的舒張反應性［11］，導致血管功能障礙及細胞蛋白、膜脂質和核酸破壞。SOD是一種重要的氧自由基清除劑，能使 O2-還原成無毒的H2O2。

葛根素(puerarin，Pue)是從野葛 Puerarin Lobata(Willd)Ohwi或甘葛藤P.thomsonii Benth的根中提取的主要有效成分之一，屬于異黃酮類化合物，化學名為4，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮。葛根素的藥理作用較多，臨床應用也非常廣泛，它在心血管疾病中有保護血管等作用［12］。本實驗觀察到，糖尿病對照組大鼠的胃組織SOD水平下降，MDA含量增高;胃組織eNOS表達以及NO濃度較正常鼠降低，血sEPCR濃度高于正常鼠;胃組織微血管超微結構有損傷，CD34標記的胃微血管面積百分比也較正常鼠明顯下降。而葛根素治療的DP組糖尿病鼠與未治療的DC組比較，這些改變得到了逆轉或改善。說明給早期2型糖尿病大鼠進行葛根素治療，可以改善大鼠胃組織的氧化應激反應，保護胃血管內皮NO的能力以及減少內皮細胞的破壞脫落，可以預防和改善胃組織微血管超微結構的損傷。其研究也證實，葛根素可提高2型糖尿病大鼠血清抗氧化酶活性，降低脂質過氧化程度［13］。

糖尿病不同病期可出現胃排空加快或減慢，已有的研究結果報道不一。本實驗顯示，STZ加高糖高脂飼料誘導的糖尿病大鼠，在5周時胃排空速率比較同期的正常鼠是增加的;而同期經葛根素干預的糖尿病大鼠，胃排空速率較糖尿病對照組延遲。研究數據顯示，葛根素對正常鼠也有延遲胃排空速率的趨勢，但無統計學意義。韓艷梅等研究顯示［14］，經單次腹腔大劑量注射STZ聯合肌注氫化可的松和利血平制備的糖尿病胃腸病大鼠，每日500 mg/kg葛根素灌胃1次共12周，可明顯降低大鼠胃殘留率，降低血漿內皮素水平，增加胃竇組織NO含量，認為葛根素具有調整血管內皮細胞分泌功能，預防糖尿病胃腸病變發生的作用。但本實驗中葛根素減慢了糖尿病大鼠的胃動力，提示葛根素可能具有雙向調節胃運動的功能。

進一步多元逐步回歸分析顯示，與胃排空最相關的因素是eNOS-OD。前已述及，eNOS是NO合成的關鍵酶，其活性變化能直接調節NO的生成及其生物學效應。這個結果提示胃血管內皮細胞損傷可能是2型糖尿病大鼠早期胃動力異常的始動因素，改善胃血管結構及功能損害有望糾正糖尿病胃動力異常，進而有助于糖尿病的防治。

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Effect of puerarin on the gastric vessel disease in type 2 diabetic rats and its relationship with gastric motility

LI Wei-xin1，ZHOU Yun1，SUN Xiao-wei2，WANG Fang1，YAN Xiang1(1．First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China; 2．Basic Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

Objective:To investigate the effects of Puerarin on early period gastric vasculopathy in type 2 diabetic (T2DM)rats，and the relationship with gastric motility.Methods:Rat model of T2DM were randomly divided into normal control group(NC)，normal+Puerarin group(NP)，diabetes control group(DC)and diabetes+Puerarin group(DP). Half time of gastric emptying(TIME 1/2)，emptying rate(RATE)，soluble endothelial cell protein C receptor(sEPCR) of serum，Nitric oxide(NO)，malonyldialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，endothelial nitric oxide synthase (eNOS)and CD34 in gastric tissue were measured.Electron microscope stomach microvascular ultrastructure were observed.Results:Compared with NC group，DC rats has higher sEPCR，MDA，and RATE，but SOD，NO，eNOS，CD34 and TIME 1/2 decreased.Stomach microvascular ultrastructure has damaged.Compared with DC group，these substances have opposite appearance.The results of Multivariate stepwise regression analysis showed that eNOS related to TIME 1/2. Conclusion:Puerarin can improve gastric motility disorders，gastric microvascular endothelial injury，and gastric tissue oxidative stress.Gastric vascular endothelial cell injury may be the initiating factor for the gastric motility disorder.

Puerarin;Type 2 diabetes mellitus;Gastric motility;Gastric vasculopathy;Animal models

R587.1

:B

:1006-3250(2015)11-1392-04

2015-03-25

甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1208RJZA229);甘肅省衛生行業科研計劃項目(GSWST09-04)

李維辛(1973-)，甘肅蘭州人，副教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事糖尿病等疾病的臨床與實驗研究。