活血化痰方干預糖尿病大鼠的尿液代謝組學分析*

潘 秋，趙慧輝，陳建新，董 芳，王 偉△

(1.北京市門頭溝區中醫院內分泌科，北京 102300;2.北京中醫藥大學研究生院，北京 100029;3.首都師范大學分析測試中心，北京 100037)

采用高脂飼料疊加腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)制備的糖尿病大鼠模型在糖尿病研究中應用廣泛。筆者在前期研究中發現，該模型具備中醫證候屬性，屬于“脾氣虧虛、痰瘀互阻”證范疇[1-2]。文獻研究結果亦證實，此證候在臨床實際中出現頻率較高[3]，因此此種造模方法復制的糖尿病模型符合中醫藥研究需求。筆者以導師臨床經驗為指導思想，以具有活血化痰功效的復方(蒼術、白術、黃芩、丹參)反證糖尿病大鼠模型的證候屬性，并借助高通量組學技術，旨在闡釋中醫證候的生物學特點和復雜中醫藥干預手段的多靶點效應。代謝組學是目前新興的系統生物學技術之一，其與中醫學有著異曲同工之妙，因此筆者擬采用代謝組學技術，從微觀角度動態揭示中藥復方療效的生物學特征，通過氣相色譜-質譜聯用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)等技術建立動態的大鼠尿液“代謝指紋圖譜”，通過數據分析最終找出特征性的代謝產物群，確定“中醫證候療效相關代謝譜”。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性8周齡SD大鼠80只，體質量(220±10)g，由北京維通利華實驗動物中心提供(許可證號SCXK(京)2002-0003)。飼養于北京中醫藥大學清潔級動物室，室溫18～25℃，相對濕度50% ～60%，大鼠適應性飼養1周。

1.2 飼料

普通飼料及高脂飼料購于中國科學院動物所。高脂飼料配方(按質量比):20%豬油，10%蔗糖，23%酪蛋白，0.3%蛋氨酸，28%淀粉，10%糊精，7.5%纖維素，0.3%膽堿，0.1%多維預混料，0.8%多礦預混料[4]。

1.3 藥物

活血化痰方由蒼術、白術、黃芩、丹參等按比例組成，由北京中醫藥大學中藥學院提供，采用水提法制成1 g/ml水溶液，中藥組大鼠每日8時灌胃，藥液于4℃冰箱保存;西藥組大鼠給予馬來酸羅格列酮片，購自葛蘭素史克公司，制成0.2 mg/ml水溶液，每日同時間灌胃。

1.4 試劑

STZ(批號S0130)，購自北京邦定泰克生物技術有限公司;乙腈(A996-4)，Fisher Scientific;吡啶(110-86-1)，MREDA TECHNOLOGY INC;三氯甲烷(67-66-3)，MREDA TECHNOLOGY INC;17碳脂肪酸(H3500-5G)、TMCS(386529-100 ml)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺(394866 10×1 ml)，均為美國Sigma試劑公司提供。

1.5 儀器

美國Finnigan Trace 2000/Trace DSQ氣相色譜-質譜聯用儀，配有RTx-5毛細管柱、Xcalibur工作站、NIST譜庫;氮氣吹干機。

1.6 方法

1.6.1 造模方法 模型組高脂飲食喂養6周后，腹腔注射STZ 35 mg/kg，對照組普通飲食喂養6周后，腹腔注射同等劑量0.1 M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射STZ 4周后2組大鼠尾靜脈采血檢測血糖，凡血糖值符合空腹血糖≥11.1 mmol/l者納入實驗[5]。

1.6.2 分組 按血糖水平將大鼠從輕到重依次編號，按隨機數字表選擇一行數字，每3只大鼠同時分組，規定根據隨機數字由小到大分別進入中藥組、西藥組、模型組。中藥組每只大鼠分別灌胃4 ml，西藥組每只大鼠灌胃馬來酸羅格列酮1 ml，模型組和對照組均灌服制水，每日8∶00給予灌胃，連續灌胃6周。

1.6.3 血糖、血脂測定 實驗6周過程中每周測定OGTT30 min血糖，出現血糖恢復的大鼠則給予剔除;血脂檢測交由東直門醫院檢驗科。

1.6.4 尿樣留取 藥物干預第3周末及第6周末分別利用代謝籠留取中藥組、模型組、對照組大鼠24 h尿液，每組隨機選取8只，每只大鼠留取尿液1ml，分別保存于不同的試管中，檢測前保存于－80℃冰箱。

1.6.5 GC-MS樣本預處理 600 μL尿液，加入10 μL內標(17碳脂肪酸6 mg/ml)，加入400 μL乙腈，渦旋混合1 min，冰浴超聲10 min，18000 r/min，4℃離心5 min，取上清干凈試管中，氮氣吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/ml)混勻，30℃肟化2 h。加衍生化試劑(MST-FA:TMCS=100∶1，v/v)50 μL，混勻靜置。1 h后移取上清液到微量進樣管，供 GC-MS 分析[6]。

1.6.6 GC-MS分析條件 氣相條件:分流比，1∶1.進樣量 0.5 μL。進樣口溫度 280℃，接口溫度250℃;升溫程序80℃;保持2 min，以每分鐘10℃升至140℃，以每分鐘 4℃升至240℃，再以每分鐘10℃升至280℃，保持3 min。離子源溫度200℃，載氣高純度氦氣。質譜條件:載氣流速，1.0 ml/min;電離方式EI;電子能量70 eV，掃描范圍50～800 m/z[7]。

1.6.7 總離子流圖分析 物質鑒定采用質譜自帶軟件;GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰，獲取各峰與內標峰的峰面積數據，用相對峰面積(與內標峰的比值)表示代謝物的含量。

1.6.8 統計學方法 根據GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰，獲取各峰與內標峰的峰面積數據，用相對峰面積(與內標峰的比值)表示代謝物的含量[8]。各組模式識別采用主成分分析(PCA)，應 用 SIMCA-P+軟 件 (V12.0.1，Umetrics，Sweden)。

2 結果

2.1 血糖水平

表1顯示，39只大鼠造模成功，18只大鼠血糖恢復給予剔除，3只大鼠死亡。西藥組灌胃4周后血糖水平出現下降(P＜0.05)。同樣在隨后第5～6周血糖水平持續處于低位水平;模型組大鼠灌服制水，血糖水平前后6周始終保持穩定(P＞0.05)。

表1 葡萄糖耐量實驗30 min血糖(mmol/L)

2.2 血脂水平

表2顯示，與模型組比較，中藥組灌胃6周后大鼠的膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平明顯低于模型組(P＜0.05);西藥組灌服6周后大鼠的膽固醇水平低于模型組(P＜0.05);與西藥組比較，中藥組低密度脂蛋白水平優于西藥組(P＜0.05)，其余指標水平相當(P＞0.05)。

2.3 總離子流圖

圖1～8顯示，第3周和第6周中藥組、西藥組、模型組和對照組總離子流圖。

2.3.1 第3周總離子流圖

2.3.2 第6周總離子流圖

表2 4組大鼠CHO TG HDL LDL水平比較

圖1 中藥組總離子流圖

圖2 西藥組總離子流圖

圖3 模型組總離子流圖

圖4 對照組總離子流圖

圖5 中藥組總離子流圖

圖6 西藥組總離子流圖

圖7 模型組總離子流圖

圖8 對照組總離子流圖

圖9 模型組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA得分圖

2.4 代謝物鑒定

表3顯示，共有峰挑選后發現尿液中共有內源性代謝物9種。利用NIST質譜數據庫對共有的內源性代謝物作鑒定，按通常匹配度大于80%的鑒定結果作為可信度較大的物質。按保留時間分別為丙氨酸、戊二酸、L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、棕櫚酸、十八烷酸、單甘油。

表3 GC-MS尿液代謝物鑒定

2.5 GC-MS圖譜模式識別分析

2.5.1 模型組前后比較 模型組前后2個時間點PCA得分圖和載荷圖結果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個主成分累積得分為67.2%，疊加后續2個主成分，共計4個主成分累積得分85.7%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個區域，第6周樣本分布于右方，第3周樣本分布于左方(結果見圖 9、10)。

2.5.2 同一時間點模型組、對照組比較 ①第3周模型組、對照組互相比較:模型組、對照組PCA得分圖和載荷圖結果表明，2組基本可以沿t2軸分開，PCA前2個主成分累積得分為67.4%，疊加第3個主成分，共計3個主成分累積得分84.2%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個區域，對照組樣本分布于上方，模型組樣本分布于下方(結果見圖11、12)。②第6周模型組、對照組互相比較:模型組、對照組PCA得分圖和載荷圖結果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個主成分累積得分為53.3%，疊加后續3個主成分，共計5個主成分累積得分85.8%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見，各樣品分布于得分圖的2個區域，對照組樣本分布于左方，模型組樣本分布于右方(結果見圖13、14)。

圖10 模型組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA載荷圖

圖11 第3周模型組、對照組尿液TIC譜圖數據PCA得分圖

圖12 第3周模型組、對照組尿液TIC譜圖數據PCA載荷圖

圖13 第6周模型組、對照組尿液TIC譜圖數據PCA得分圖

圖14 第6周模型組、對照組尿液TIC譜圖數據PCA載荷圖

圖15 中藥組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA得分圖

圖16 中藥組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA載荷圖

圖17 西藥組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA得分圖

圖18 西藥組前后比較尿液TIC譜圖數據PCA載荷圖

2.5.3 中藥組前后比較 中藥組前后2個時間點PCA得分圖和載荷圖結果表明，2組基本可以沿t2軸分開，PCA前2個主成分累積得分49.0%，疊加后續3個主成分，共計5個主成分累積得分86.9%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個區域，第6周樣本分布于下方，第3周分布于上方(結果見圖15、16)。

2.5.4 西藥組前后比較 西藥組前后2個時間點PCA得分圖和載荷圖結果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個主成分累積得分72.5%，疊加第3個主成分，共計3個主成分累積得分87.2%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個區域，第6周本分布于右方，第3周布于左方(結果見圖17、圖18)。

2.6 代謝物組內及組間比較結果

2.6.1 組間比較 第3周根據主成分分析結果，各組比較未見統計學差異;第6周與對照組比較，模型組L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸、十八烷酸含量增加(P＜0.05或P＜0.01)(結果見表3)。

2.6.2 組內比較 第6周中藥組L-抗壞血酸(29 min)含量減少(P＜0.05);第6周模型組L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量增加(P＜0.05或P＜0.01)(結果見表4)。

3 討論

3.1 尿液代謝物濃度的變化

筆者以往實驗研究表明，糖尿病大鼠前3周證候屬性以脾氣虧虛證為主，后3周證候屬性以痰瘀互阻證為主。尿液代謝物鑒定結果顯示，與第3周比較，第6周模型組大鼠尿液中L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量均明顯增加。L-抗壞血酸含量增高可能是大鼠發生糖尿病后體內氧化水平激增，機體通過自身調節而出現的抗氧化反應;十八烷酸是硬脂酸，屬于高級飽和脂肪酸，存在于部分植物性油脂和動物性油脂中，飽和脂肪酸的增加可能會引起血液中膽固醇含量上升，并促使機體對胰島素等激素產生抵抗，導致血糖升高等代謝紊亂情況出現。查閱KEGG檢索丙氨酸與相關疾病的關系發現，丙氨酸異常多見于代謝異常性疾病，這可為今后實驗提供繼續研究的靶點。綜上所述，幾種代謝物的組合規律及其含量的變化基本可以闡釋大鼠中醫證候的相關代謝物特征。

表4 GC-MS大鼠尿液代謝物組內及組間比較(例)

3.2 活血化痰方的藥效機制

尿液代謝物鑒定結果顯示，與第3周比較，第6周中藥組大鼠尿液中L-抗壞血酸含量減少，可能是中藥復方減輕糖尿病大鼠體內的氧化應激作用，因而L-抗壞血酸含量反應性下降。同時，第6周中藥組大鼠尿液出現部分代謝物消失，包括丙氨酸、棕櫚酸、十八烷酸和單甘油，并出現了新的代謝物如L-抗壞血酸等物質，可能是中藥復方增強了抗氧化作用;此外，硬脂酸和軟脂酸含量減少，提示中藥具有改善血脂代謝的作用，可能是通過改善血脂代謝進而影響了血糖水平，或者是通過減輕胰島素抵抗的間接作用而改善高血糖狀態;丙氨酸水平的下降，從一定程度上說明中藥影響了部分氨基酸代謝通路，改善了代謝紊亂狀態。

3.3 氣質聯用技術

氣質聯用技術主要應用在植物代謝組學研究中，分析時需對樣品進行衍生化處理以增加樣品的穩定性和揮發性，利于用GC-MS中的氣相色譜儀進行分離。因此，GC-MS限于分析揮發性物質，無法分析膜脂等熱不穩定性的物質和分子量較大的代謝產物。筆者以糖尿病病證結合大鼠的尿液為樣本，根據不同組別、不同代謝產物含量變化對大鼠的證候和證候療效做出初步闡釋。如果結合其他代謝組學技術，可能會發現更多有意義的代謝物，以便更深入地闡釋糖尿病病證結合大鼠的證候特征以及證候療效的科學內涵。由于國內關于代謝組學的研究起步較晚，而涉及糖尿病中醫學范疇的文獻研究也比較少，因此可借鑒的研究結果為數不多。對于實驗結果在2型糖尿病病證結合動物模型的其他證型中是否有相同實驗結果或者出現新的標志性代謝物，這將是課題組今后實驗研究的重點所在。

受到大鼠樣本量的限制和大鼠模型的個體差異，各組大鼠尿液代謝物在種類和含量上出現一定程度的偏差，筆者建議在今后的實驗中可以從兩方面進行改進。首先可以增加實驗動物的樣本量，二是可以提高實驗動物的造模嚴重程度，有利于發現差異明顯的代謝物群。此外，作為最終代謝物，大鼠的尿液可能在疾病程度較輕的階段不出現明顯的變化，筆者認為可以結合血液檢測方法開展血液代謝組學研究，可能會發現與糖、脂、蛋白代謝紊亂明顯相關的生物標志物。同時，今后的研究也可以借助系統生物學的其他技術方法如蛋白組學和基因組學，深入開展2型糖尿病大鼠病證結合研究，期望通過不同組學技術交叉印證證候的相關生物學機制，并借助復雜統計學方法，將系統生物學結果與一般實驗指標、宏觀表征融合成有機的整體，探索出一條由宏觀延伸到微觀、由微觀反證宏觀的有效實驗方法，探尋宏觀指標和微觀指標之間的關聯性，努力找到可以代替微觀指標的宏觀指標，以此加快證候研究的步伐。

[1]潘秋，趙慧輝，陳建新，等.2型糖尿病大鼠表征及其證候特征研究[J].中華中醫藥雜志，2011，4(26):683-685.

[2]潘秋，趙慧輝，陳建新，等.糖尿病大鼠脾氣虧虛、痰瘀互阻證的尿液代謝組學分析[J].中國中醫基礎醫學雜志，2013，19(3):276-279.

[3]尹德海，梁曉春，樸元林，等.2型糖尿病患者中醫證型分析及其與糖尿病慢性并發癥關系的探討[J].中國中西醫結合雜志，2009，29(6):506-510.

[4]M.J.Reed，K.Meszaros，L.J.Entes，et al.A new rat model of type 2 diabetes:the fat-fed，streptozotocin treated rat[J].Metabolism，2000，49:1390-1394.

[5]馮建華，姜國勝，徐云生，等.活血化痰法改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗的作用機制研究[J].中華中醫藥雜志，2009，24(8):1014-1020.

[6]簡維雄，黃獻平，陳清華，等.基于氣相色譜-質譜的大鼠心血瘀阻證血漿代謝組學研究[J].中華中醫藥學刊，2009，27(4):796-798.

[7]簡維雄，袁肇凱，黃獻平，等.冠心病心血瘀阻證尿液代謝組學的檢測分析[J].中醫雜志，2010，51(8):729-732.

[8]孫永寧，馮雯，劉忠.糖尿病腎陰虛證模型大鼠血液標本的代謝組學研究[J].2010，34(1):80-82.