缺氧及復氧對hepG2細胞STC-1和STC-2的mRNA表達影響

吳子安, 譚志容, 徐 寧, 李 濤, 李 曼, 尹芳芳

(1. 廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院, 廣東 廣州 510370； 2. 廣州中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院, 廣東 廣州 510405)

缺氧及復氧對hepG2細胞STC-1和STC-2的mRNA表達影響

吳子安1, 譚志容2, 徐 寧1, 李 濤1, 李 曼1, 尹芳芳2

(1. 廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院, 廣東 廣州 510370； 2. 廣州中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院, 廣東 廣州 510405)

目的:研究缺氧及復氧對hepG2細胞STC-1和STC-2的mRNA表達影響。方法:用化學缺氧劑氯化鈷模擬缺氧環(huán)境,用RT-PCR法分別檢測在hepG2細胞缺氧和復氧條件下STC-1、STC-2的mRNA表達情況。結(jié)果:在hepG2細胞中,STC-1 mRNA無論在缺氧還是復氧情況下,幾乎不表達；STC-2 mRNA在缺氧條件下表達升高,并隨著缺氧時間延長而升高,復氧后表達又降低,并隨復氧時間延長而恢復至正常。結(jié)論:STC-2與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。

hepG2細胞; 人斯鈣素-1; 人斯鈣素-2; 缺氧; 復氧

近年來腫瘤發(fā)病率不斷升高,早期的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療可降低死亡率、有效改善預后。因此,尋找合適的腫瘤標志物一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。隨著對腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)機制了解的不斷深入,對多種信號通路和生物大分子在腫瘤中作用的確立,新的腫瘤標志物不斷出現(xiàn)。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物有上百種,但缺乏高敏感性和高特異性,真正能夠用于臨床的相當有限。人斯鈣素(human stanniocalcin,hSTC)是近年來比較受關(guān)注的潛在腫瘤標志物之一,很多圍繞hSTC功能或作為腫瘤標志物可行性的研究已經(jīng)展開。

斯鈣素(stanniocalcin,STC)是一種糖蛋白激素,由Stannius首先在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)[1]。人類STC家族(hSTC)由STC-l和STC-2組成,以旁分泌和自分泌的方式參與機體的多種生理功能[2]。隨著對STC研究的深入,不斷有研究表明 STC 的表達與人類癌癥的發(fā)展過程相關(guān)[3]。缺氧是腫瘤細胞生存環(huán)境的常態(tài)。研究證明缺氧刺激可以促使包括結(jié)腸癌、鼻咽癌、卵巢癌在內(nèi)的多種人類癌細胞的STC-1基因表達。本研究意在探索肝癌細胞中氧含量的變化對STC表達的影響,評價STC能否成為肝癌早期檢測的指標。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝癌細胞株 (hepG2)來自本實驗室,gibico DMEM培養(yǎng)基,hyclone胎牛血清,gibco胰酶,氯化鈷。

Thermo紫外分光光度計、Thermo臺式高速冷凍離心機、sartorius天平、ABI梯度PCR儀、ROCHE逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；STC-1上游引物為5-CAAACCCAACTAAGCCAGGA-3,下游為5-CAGCAAACACAAGACGAAGC-3,擴增片段長度為320bp；STC-2上游引物為5-CCAAATCCAATCCCAGTCTT-3,下游為5-ACTCAGCAACGCAGGAGAAT-3,擴增片段長度為333bp；GAPDH作為內(nèi)參照,其引物為上游5-GGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3和下游5-CAAATGAGCCCCAGCCTTC-3,擴增片段長度為330bp; HIF-1上游引物為5-CTCAAAGTCGGACAGCCTCA-3,下游為5-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3,擴增片段長度為441bp；VEGF-A上游引物為5-CTCTACCTCCACCATGCCAAGT-3,下游為5-ATCTGGTTCCCGAAACCCTGAG-3,擴增片段有兩條,長度為VEGF121 445bp,VEGF165 577bp,引物委托Invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將細胞用含10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基在12孔板中培養(yǎng)。將第一孔設(shè)為對照組,其余孔分別加氯化鈷溶液至終濃度為200 μmol/L,置于培養(yǎng)箱中37 ℃、5%二氧化碳中培養(yǎng)。

1.2.2 計時提取RNA

分別在加氯化鈷1、3、6、12、24 h及復氧1h、3h、6h、12h時用TRIzol 試劑以硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA。

1.2.3 RNA濃度及純度檢測

提取的RNA沉淀用20μL的DEPC水溶解,用紫外分光光度計測定A280/A260值、RNA純度(比值均在1.8～2.0之間)及含量計算。

1.2.4 RT-PCR及PCR

逆轉(zhuǎn)錄步驟參照試劑盒說明書進行。具體操作為在冰上取總RNA 1μg、Oligo(dT )1 μL,加DEPC水將體積補至13 μL于0.2 mL微量離心管中。瞬時離心后置PCR儀中65 ℃、10 min；再置于冰上5 min,分別加入5×buffer 4 μL、dNTP mix 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、Transcriptase 0.5 μL后再置于PCR儀中。PCR儀反應(yīng)程序:55℃、30 min 1循環(huán);85 ℃、5 min 1循環(huán);4 ℃、無限循環(huán)。PCR反應(yīng)體系:master mix 12.5 μL,目的基因上下游引物各1 μL,cDNA1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 預變性2 min； 94 ℃、30 s,60 ℃、30 s、72 ℃、45 s,35個循環(huán)；72 ℃ 8、min。

1.2.5 電泳及凝膠成像

PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳,并用marker作比較,在凝膠成像儀上判斷PCR產(chǎn)物片段大小及得到條帶灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 缺氧模型的建立

HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于哺乳動物體內(nèi),是由α、β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α是特異性催化亞基。在缺氧時HIF-1α表達增加,與HIF-1β形成穩(wěn)定復合體,調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長因子VEGF-1等的表達,使細胞和組織適應(yīng)缺氧狀態(tài)[4]。故選取HIF-1α、VEGF-1作為缺氧標志。將hepG2細胞以200 μmol/L的氯化鈷[5]分別處理1、3、6、12、24 h,提取總RNA,用RT-PCR測HIF-1 mRNA、VEGF mRNA的表達，結(jié)果見圖1。由圖1可知，氯化鈷缺氧處理組較正常對照組的HIF-1 mRNA的表達量升高,且隨處理時間的延長而升高。圖2結(jié)果趨勢與圖1類似,但比圖1更明顯。二者表達量的升高經(jīng)統(tǒng)計檢驗,P<0.05。這些結(jié)果表明,200 μmol/L的氯化鈷確實能使細胞缺氧,缺氧模型構(gòu)建成功。VEGF、HIF-1、STC-2缺氧復氧環(huán)境下的表達量見表1。

圖1 缺氧環(huán)境下HIF-1α表達情況

圖2 缺氧環(huán)境下VEGF-1

表1 VEGF、HIF、STC-2缺氧-復氧環(huán)境下的表達量

注：P值為VEGF、HIF、STC-2在不同缺氧、復氧時間段的表達差異比較

2.2 STC-1、STC-2 mRNA表達

如圖4所示,hepG2細胞在缺氧條件下,STC-1 mRNA表達用普通PCR方式幾乎檢測不到；如圖5所示,在hepG2細胞中,STC-2 mRNA表達在缺氧刺激下上調(diào)(P<0.01),且呈時間依賴模式,缺氧時間越長其表達量越多。恢復常氧條件時這種上調(diào)的表達可以可逆地下調(diào)。

圖4 缺氧條件下STC-1mRNA表達情況

圖5 缺氧條件下STC-2mRNA表達情況

3 討論

缺氧是腫瘤細胞生存環(huán)境的常態(tài)。研究證明，缺氧刺激可促使包括結(jié)腸癌、鼻咽癌、卵巢癌在內(nèi)的多種癌細胞的STC-1基因表達。RNA干擾技術(shù)進一步證實內(nèi)源性HIF-1是缺氧誘導的STC-l表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,HIF-1直接與STC-1啟動子區(qū)域相結(jié)合,調(diào)節(jié)STC-1的表達。此外,STC-2也是HIF-1作用的靶基因之一。Law等[6]使用卵巢癌細胞研究結(jié)果表明,缺氧條件下HIF-l可以上調(diào)STC-2表達，促進細胞增殖。STC-2在缺氧條件下表達上調(diào)可能是腫瘤細胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的一種反應(yīng)[6]。為研究腫瘤細胞氧含量變化是否會影響STC的表達,研究中選擇肝癌細胞進行實驗。肝癌在我國是一種常見的腫瘤,具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展迅速、治療棘手、療效欠佳、病死率高特點，故早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷尤為重要。肝癌又是一種多血管腫瘤,對血管有很強的依賴性。血循環(huán)中氧含量的變化對肝癌細胞的影響頗大。本研究意在探索肝癌細胞中氧含量的變化對STC表達的影響,評價STC能否成為肝癌早期檢測的指標。

STC是近來新興的待開發(fā)腫瘤標志物。一系列臨床病例對照試驗表明,在胃癌、大腸癌、肺腺癌、乳腺癌等組織或外周血標本中,STC表達明顯增多,且與疾病嚴重程度及預后相關(guān)。在侵入性乳腺癌中，STC-2可作為預兆標志物,并與較長的無病生存率(disease flee survival,DFS)相關(guān)。STC-1可能是脈絡(luò)叢腫瘤敏感和特異的標志物。在白血病患者診斷和復發(fā)時STC-1轉(zhuǎn)錄水平升高[7]。在人類中,STC-1主要表達于卵巢、腎、前列腺、甲狀腺、胰腺細胞、神經(jīng)、骨和肌肉,但主要集中在卵巢。STC-2主要在腎臟、心臟、胰腺和脾臟表達。鄔匡杰等[8]檢測STC-2 基因在15種人體正常組織 (腦、心、肺、脾、腎、 胃、食管、小腸、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、胎肝、肝及睪丸 )和肝癌組織中的表達研究中顯示,STC-2在正常肝中表達量極低,而在肝癌組織與癌旁組織中表達有明顯差異。

本課題實驗結(jié)果顯示,缺氧可以引起STC-2 mRNA表達升高,但對STC-1 mRNA表達幾乎不影響。腫瘤細胞外環(huán)境氧含量的變化確實能影響STC-2的表達。缺氧時,STC-2 mRNA表達量增多,與缺氧時間呈正相關(guān)；復氧后,其表達量又能逐漸下調(diào)。現(xiàn)有研究[9]已經(jīng)證明，HIF-1在STC表達上調(diào)中起重要的作用，這可能是缺氧信號先引起HIF-1增多,HIF-1再作用其下游靶基因如VEGF、STC等,促進缺氧區(qū)血管生成,維持腫瘤細胞的生存和代謝等以提高腫瘤細胞的缺氧耐受性。而其中的信號轉(zhuǎn)導途徑,調(diào)節(jié)機制仍待進一步研究。另外,STC表達量的變化與缺氧密切相關(guān),而腫瘤細胞的生長速度和存活狀態(tài)常受到氧含量的調(diào)控。一方面因為腫瘤細胞增殖快,對氧的需求高；另一方面,血管的生長跟不上腫瘤的生長,使得部分腫瘤區(qū)域供血不足,細胞缺氧。故腫瘤與STC亦密切相關(guān)。Iata等[10]檢測138例結(jié)腸癌患者組織中STC-2的表達發(fā)現(xiàn)，其表達量與腫瘤大小、浸潤深度、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期等相關(guān)。Kanellis等[11]研究發(fā)現(xiàn)，STC-1可有效抑制免疫反應(yīng)助腫瘤細胞逃避患者免疫系統(tǒng)的攻擊等研究結(jié)果。這些可以得出STC作為一個新的腫瘤標志物有較高的臨床應(yīng)用價值。除此之外,借由STC表達與缺氧的相關(guān)性,STC的檢測亦可為血管栓塞性疾病提供一種輔助檢查手段評估局部缺氧及耐受情況[12]。但本研究只是針對缺氧時STC 在轉(zhuǎn)錄水平的影響,對其翻譯水平的影響欠缺。STC作為檢測指標的具體可行性還需要結(jié)合一定數(shù)量臨床病例研究,診斷性試劑盒開發(fā)技術(shù)有待進一步探索。

References)

[1] 張延濤,王靜蓉,李曉燕,等.人類斯鈣素生物學特性的相關(guān)研究[J].醫(yī)學綜述,2009,15(19):2926-2928.

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[3] 郝衛(wèi)剛.人類斯鈣素與腫瘤相關(guān)性研究進展[J].重慶醫(yī)學,2011,40(36):3725-3727.

[4] 莊莉.肝細胞肝癌中HIF-1、VEGF的表達及VEGF抑制肝癌細胞增殖作用的研究[D].杭州:浙江大學,2004.

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[6] Law A Y,Wong C K.Stanniocalcin-2 is a HIF-1 target gene that promotes cell proliferation in hypoxia[J].Exp C ell Res,2010,316(3):466-476.

[7] 陳維娜,朱廣瑾.斯鈣素的研究進展[J].生理科學進展,2008,39(3):225-228.

[8] 鄔匡杰,韓澤廣,蔡兵,等.斯鈣素2基因在原發(fā)性肝癌中的表達[J].中華實驗外科雜志,2011,28(3):402-405.

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[10] Ieta K,Tanaka F,Yokobori T,et a1.Clinicopathological significance of stanniocalcin 2 gene expression in colorectal cancer [J].Int J Cancer,2009,125(4):926-931.

[11] Kanellis J,Bick R,Garcia G,et al.Stanniocalcin-1,an inhibitor of macrophage chemotaxis and chemokinesis[J].Am J Physiol,2004,286(2):356-362.

[12] dos Santos M T,Trindade D M,Goncalves Kde A,et al.Human stanniocalcin-1 interacts with nuclear and cytoplasmic proteins and acts as a SUMO E3 ligase[J].Mol BioSyst,2011,7(1):180-193.

Influence of anoxia-reoxygen for expression of STC-1 and STC-2 mRNA in hepG2 cell

Wu Zian1, Tan Zhirong2, Xu Ning1, Li Tao1, Li Man1, Yin Fangfang2

(1. Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510370, China; 2. Second Clinical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective To reserch the influence of anoxia-reoxygen for the expression of STC-1 and STC-2 mRNA in hepG2 cell. Methods Using CoCl2 to simulate an anoxia environment,then detecting the expression of STC-1 and STC-2 mRNA of hepG2 cell in different timing during the process of anoxia-reoxygen.Results There is no expression of STC-1 mRNA in hepG2 cell during the whole process of anoxia-reoxygen.But there is an expression of STC-2 mRNA in hepG2 cell when it is anoxia.The degree of the expression will be increased for the length of the time of anoxia and returned to normal after reoxygen. Conclusion There is a close correlation between STC-2 and liver cancer in occuring and developing process.

hepG2 cell; STC-1; STC-2; anoxia;reoxygen

2015- 02- 19

廣東省醫(yī)學科研基金立項課題(B2013169)

吳子安(1980—)，男，廣東順德，碩士，主管技師，主要研究領(lǐng)域為臨床免疫學

E-mail：beancurdwu@163.com

徐寧(1970—)，男，河南夏邑，博士，主任技師，碩士研究生導師，研究方向為生物化學.

E-mail：xu_ning21@163.com

Q57

B

1002-4956(2015)8- 0058- 04