細針穿刺細胞塊的制作和免疫細胞化學在乳腺癌診斷和術前化療中的意義

彭芳 ，王建 ，張功亮 ，鐘斌

(1、贛州市人民醫院病理科，江西 贛州 341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西 贛州 341000)

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，早期發現并治療乳腺癌具有很大意義。細針穿刺細胞學檢查具有準確、快速、方便和創傷小的特點，廣泛用于臨床初步判斷腫瘤的良惡性。特別在乳腺腫瘤方面，因乳腺腫瘤位置表淺，操作方便，不容易損傷血管神經，已成為術前判斷乳腺腫瘤良惡性的主要手段[1-3]。然而細針穿刺傳統涂片由于涂片厚，細胞重疊，厚薄不均，細胞結構、背景不清晰，細胞量少，特別是不宜進行ER、PR、C-erbB-2和Ki-67這些重要內分泌標記物的測定而有一定的局限性。本研究探索一種既操作方便又能準確反應患者內分泌情況的方法。

我們對40例乳腺癌患者進行細針穿刺細胞學檢測，在常規涂片瑞氏染色做出細胞學診斷后剩余部分細胞制成細胞蠟塊，行HE染色及免疫細胞化學方法檢測乳腺癌靶向治療相關的ER、PR、C-erbB-2和Ki-67的表達情況，并與術后組織切片免疫組化結果進行對照研究，以此探討穿刺細胞塊的制作和免疫細胞化學在乳腺癌診斷和術前化療中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月-2015年1月，在我院有手術病理學結果并在術前做細針穿刺細胞學并制作細胞塊的乳腺癌患者40例。患者均為女性，年齡26~77歲，平均年齡44歲，左側病灶28例，右側病灶12例，腫物大小0.6cm~7cm。所有病例手術前均無放療、化療和激素治療病史。

1.2 細胞塊的制備 對乳腺腫塊的患者，穿刺前檢查腫物位置、大小、硬度、活動度和邊界，碘伏消毒，左手固定腫物，右手用10ml普通注射器進行穿刺，快速穿刺入腫物，保持5~8ml負壓，通過快速抽提8~10次，對腫物進行反復切割，同時借助針管內的負壓將標本吸入穿刺針內，涂片2張，做瑞氏染色細胞學檢查。剩余標本直接打在玻片上并聚攏，滴2次95%的酒精覆蓋組織自然風干，酒精和標本中的部分血液有使其凝固和保持部分組織結構的作用。此時組織已經粘附在玻片上，組織和玻片直接放入10%的中性福爾馬林中固定8h后常規包埋、制片。

1.3 免疫細胞化學方法 免疫組化試劑一抗采用福州邁新生物技術開發公司生產的ER、PR、C-erbB-2、Ki-67。檢測系統也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細胞塊石蠟切片厚度3~4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 結果判定 浸潤性乳腺癌ER PR陽性定位于細胞核，以細胞核出現棕黃色顆粒者為陽性，若細胞膜或細胞質出現棕黃色顆粒視為陰性。陽性細胞數占所有腫瘤細胞數的比例稱為陽性率，即在高倍鏡(400×)下借助鏡標尺計數陽性細胞數和腫瘤細胞數，連續觀察10個高倍視野，計數陽性細胞比例=陽性細胞數之和/腫瘤細胞數之和×100%。評分采用ASCO/CAP發表的檢測指南以1%為陽性界值判斷腫瘤細胞陽性率并參考Allred評分法，陽性率評分如下：陰性記O分，A11red評分法將 1%~10%評為（+），11%~33%評為（++），>33%評為（+++）；染色強度評分如下：陰性(高倍鏡無任何細胞核染色)O分，弱(僅在高倍鏡能分辨細胞核染色)1分，中度 (低倍鏡能分辨細胞核染色)2分，強(低倍鏡明顯細胞核染色)3分。

HER2陽性定位于細胞膜，評分采用2013年ASCO/CAP發布的最新指南：陰性：未觀察到染色或≤10%腫瘤細胞出現不完整、微弱或難以察覺的細胞膜染色。>10%腫瘤細胞出現不完整、微弱或難以察覺的細胞膜染色為（1+）。>10%腫瘤細胞出現不完整和(或)微弱／中度細胞膜染色或≤10%腫瘤細胞出現完整的細胞膜強陽性染色為（2+）。>10%腫瘤細胞出現完整的細胞膜強染色為（3+）。

Ki-67陽性定位于細胞核，計數陽性比例高的區域陽性細胞的百分比。

2 結果

2.1 細胞塊HE及免疫染色結果 穿刺細胞學檢查獲取的細胞量較多，并含有微小顆粒，保留部分組織結構，可制備高質量的細胞塊(圖1)，有助于做出細胞病理診斷。免疫細胞化學方法顯示細胞分布較均勻，陽性著色部位準確，背景清晰 （圖2~圖4）。

圖1 細胞塊HE染色（×200）

圖2 細胞塊ER（×400）

圖3 細胞塊PR染色（×200）

圖 4 細胞塊HER-2（ ×400）

2.2 細胞塊與術后病理標本免疫化學對比結果40例細胞塊免疫細胞化學結果：ER陽性28例 （陽性率 70%）；PR陽性 27例 （陽性率 67.5%）；C-erbB-2陽性：1+有4例（陽性率 10%），2+有5例（陽性率12.5%），3+有3例 （陽性67.5%）；Ki67陽性平均值35%。術后病理免疫組織化學結果為：ER陽性30例 （陽性率 75%）；PR陽性 29例 （陽性率72.5%）；C-erbB-2陽性：1+有 5例（陽性率 12.5%），2+有 5例 （陽性率 12.5%），3+有 3例 （陽性率67.5%）；Ki67陽性平均值38%。細胞塊和術后病理標本免疫化學結果無明顯差異，其結果見表1。

表1 細胞塊與術后病理標本免疫化學結果

3 討論

細針穿刺細胞學檢查在初步診斷乳腺腫塊的良惡性是一種有效手段。乳腺癌如果早期診斷，能夠選擇最有效的治療方法，而良性的腫瘤，病人可以不用再受手術治療的痛苦[1-4]。細針穿刺細胞學檢查相對外科手術和巴德針穿刺是一種非侵襲性、痛苦小、不需要麻醉、感染機率小的診斷方法。這些標本不僅可用于做細胞學的診斷，而且可以用于免疫細胞學檢查，給診斷和治療提供有用的信息。

隨著醫療水平和人們生活質量的提高，乳腺癌的治療越來越規范，術前輔助化療成為重要的治療方法之一，輔助化療前要檢測ER、PR、CerbB-2、Ki67 的表達情況[2，3]，了解乳腺癌患者內分泌情況及惡性程度和預后，才能使臨床醫生制定出合理正確的治療方案。目前診斷乳腺癌和術前檢測以上重要生物學指標的方法有細針穿刺細胞學涂片法、粗針穿刺和切取活檢三種方法[4-6]。細胞學涂片法有時因細胞重疊，結構不清，固定不及時而使免疫細胞化學顯色時，背景不清晰，陽性反應彌散，非特異性著色，使待檢抗原在定性、定位準確率方面不夠理想，并且不能連續切片及永久性保留標本[4-10]。粗針活檢和切除活檢，操作麻煩、病人痛苦大、費用高，有時可出現出血、感染等并發癥。細針穿刺吸取細胞學檢查作為乳腺腫瘤術前或新輔助化療前定性診斷的重要手段之一，具有與空心針活檢、病理檢查相類似的作用，其診斷價值已經得到普遍的承認[4-7，11-15]。

我們用10ml細針穿刺乳腺癌組織，制備的細胞塊能夠彌補以上方法的不足之處，獲得標本量多，通常含有微小組織或顆粒，在涂片中保留丁部分組織結構特點，更有利于做出準確的細胞病理診斷，為制備高質量的細胞塊提供了保障。并且細胞采集量多，分布適中，免疫細胞化學染色效果佳，細胞塊技術最大特點是可以連續切片，能為乳腺癌術前輔助化療做多種抗體染色、原位雜交等以滿足診斷需要，并能長期保留標本。

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