早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表達及意義

鞠輝，劉希雙，夏頔，劉華，張翠萍，江月萍

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 消化內科； 2 急診內科)

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早期胃癌hMLH1和hMSH2基因表達及意義

鞠輝1，劉希雙1，夏頔2，劉華1，張翠萍1，江月萍1

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 消化內科； 2 急診內科)

目的 探討早期胃癌胃黏膜組織hMLH1和hMSH2蛋白的表達及其意義。方法 選取內鏡下切除早期胃癌組織45例、癌前病變組織38例以及胃鏡下活檢慢性胃炎組織42例，采用免疫印跡法檢測hMLH1和hMSH2蛋白的表達。結果 慢性胃炎及癌前病變組織hMLH1蛋白表達高于早期胃癌組織，差異有統計學意義(F=9.578，P<0.05)；早期胃癌組織hMSH2蛋白表達高于癌前病變與慢性胃炎組織，差異有統計學意義(F=32.952，P<0.05)。早期胃癌病人hMSH2及hMLH1蛋白表達與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型等無關(P>0.05)。幽門螺桿菌(Hp)感染組早期胃癌組織hMSH2陽性表達率低于非Hp感染組(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病變、慢性胃炎組織hMSH2陽性表達率也低于非Hp感染組，但差異無統計學意義(P>0.05)；Hp感染組早期胃癌、癌前病變和慢性胃炎組織hMLH1陽性表達率均低于非Hp感染組，但差異無統計學意義(P>0.05)。結論 在慢性胃炎、癌前病變和早期胃癌的發展過程中，hMSH2基因表達增加，hMLH1基因表達減少。Hp感染可能通過影響hMSH2與hMLH1基因表達，影響早期胃癌的發生。

胃腫瘤；癌前狀態；DNA錯配修復；幽門螺桿菌

早期胃癌是指癌組織僅限于胃黏膜層與黏膜下層，不論有無淋巴結轉移[1]。早期胃癌的早期診斷與治療可提高胃癌的治愈率。目前胃癌的發生機制不明，近來研究表明，錯配修復基因(MMR)的突變參與腫瘤的發生，MMR基因中hMLH1和hMSH2的異常改變與胃腸道腫瘤發生有關[2-3]。幽門螺桿菌(Hp)感染也被認為是胃癌發生原因之一，但是目前機制不明。既往我們分析了胃癌、癌旁組織與慢性胃炎組織中hMLH1和hMSH2的表達[4]，本文進一步分析早期胃癌、癌前病變(低級別上皮內瘤變)以及慢性胃炎組織中hMLH1和hMSH2基因表達及其與Hp感染的關系。

1 材料和方法

1.1 標本及其來源

標本均取自我院消化內鏡中心切除或活檢的胃黏膜組織。早期胃癌組織45例，術后病理檢查為高級別上皮內瘤變、高分化腺癌等；其中男28例，女17例，平均年齡為(50.3±10.6)歲。癌前病變組織38例，病理活檢為低級別上皮內瘤變；其中男26例，女12例，平均年齡為(45.3±9.4)歲。慢性胃炎組織42例，其中慢性非萎縮性胃炎24例，慢性萎縮性胃炎18例；男24例，女18例，平均年齡為(52.3±11.5)歲。將上述標本取出后進行標記號碼，統一置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2 蛋白樣品制備與免疫印跡檢測

分別取早期胃癌、癌前病變及慢性胃炎黏膜組織，搗碎，裂解，高速離心15 min。取50 μg上清液在凝膠上恒壓電泳分離3 h，轉移至PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入一抗(抗hMSH2、抗hMLH1小鼠單克隆抗體，SANTA CRUZ生物公司)，在4 ℃下與PVDF膜混合過夜。以TBS液洗滌4次，每次20 min，再與二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，聯科生物公司)結合，室溫放置2 h，然后再以TBS液洗3次，每次20 min。倒入ECL發光液，充分混合后，以保鮮膜覆蓋，暗盒中放置5 min，觀察結果。應用BIO-RAD圖像分析軟件進行分析，設空白對照相對密度值為0，以hMSH2及hMLH1蛋白表達的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示各病變組織的表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同組織hMSH2和hMLH1蛋白表達比較

慢性胃炎及癌前病變組織hMLH1蛋白的表達高于早期胃癌組織，差異有統計學意義(F=9.578，P<0.05)；慢性胃炎與癌前病變組織比較，差異無統計學意義(P>0.05)。慢性非萎縮性胃炎組織hMLH1蛋白表達與萎縮性胃炎組織比較，差異無統計學意義(P>0.05)。早期胃癌組織hMSH2蛋白表達均高于癌前病變與慢性胃炎組織，癌前病變組織高于慢性胃炎組織，差異均有統計學意義(F=32.952，P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 hMSH2和hMLH1蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

早期胃癌病人hMSH2和hMLH1蛋白表達與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型等無關(P>0.05)。見表2。

2.3 不同組織hMSH2和hMLH1基因表達與Hp感染的關系

Hp感染組早期胃癌組織hMSH2基因的表達陽性率低于非Hp感染組(χ2=22.361，P<0.05)，癌前病變、慢性胃炎組織hMSH2陽性表達率也低于非Hp感染組，但差異無統計學意義(P>0.05)；Hp感染組早期胃癌組織、癌前病變組織和慢性胃炎組織hMLH1陽性表達率均低于非Hp感染組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

①、③早期胃癌組織；②、④癌前病變組織；⑤慢性胃炎組織。

表1 各組織hMSH2和hMLH1蛋白表達比較

表2 hMSH2和hMLH1蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

3 討 論

腫瘤的發生過程中包括多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。MMR基因由一系列酶分子組成，能夠在DNA修復過程中識別錯配堿基，消除不配對堿基，具有修復DNA堿基錯配、增強DNA復制忠實性、維持基因組穩定性和降低自發性突變的功能[5-6]。hMSH2和hMLH1是MMR家族中較為重要的基因，如果出現異常，可能會導致細胞錯配修復功能缺陷，表現為復制錯誤或微衛星不穩定，因而易發生腫瘤[7-8]。hMSH2基因位于染色體2p22-21，基因全長73 000 bp，其中含有16個外顯子，cDNA全長3 116 bp，其開放閱讀框架長為2 727 bp，編碼909個氨基酸序列[9-10]。hMLH1基因則位于染色體3p21.3-23，基因全長58 000 bp，含有19個外顯子，cDNA開放閱讀框架長2 268 bp，編碼765個氨基酸序列[3,11]。hMSH2蛋白易與hMSH6、hMSH3蛋白分別形成復合體，識別錯配位點，啟動錯配修復[12]。hMLH1可與hMLH3形成復合物，協助hMLH1完成修復功能。但是大部分hMLH1基因可能會突變形成終止密碼,導致蛋白翻譯不能完成，致使其修復基因功能不全,導致腫瘤發生[13]。

表3 各組hMSH2和hMLH1基因表達與Hp感染的相關性(例(χ/%))

通常認為，胃癌發生是一個多病因、多階段的連續過程，包括慢性胃炎、癌前病變和胃癌(包括早期胃癌)[1,14]。本文結果顯示，早期胃癌組織hMSH2蛋白的表達高于癌前病變和慢性胃炎組織，考慮hMSH2蛋白在胃癌中高表達的原因可能為，在某些因素的不斷刺激下，一些增殖活躍的細胞容易出現基因的多點突變和DNA復制錯誤，使hMSH2基因表達代償性上調，但增多的基因產物仍不足以修復已發生損傷的基因，使細胞惡性轉化，也不排除hMSH2基因自身可能發生突變，編碼有缺陷的產物增加，促進腫瘤的發生。一些分化未成熟細胞，其DNA表達出現堿基錯配或缺失，需要錯配基因修復系統的修復[3]，此時MMR基因尤其是hMSH2與hMLH1表達就會發生改變，這種改變在消化道、生殖腺等組織變化更為明顯[15]。既往研究結果顯示，hMSH2蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織和胃炎黏膜組織，癌旁組織hMSH2的表達較胃炎組織明顯增多，表明癌細胞旺盛的增殖活動對hMSH2基因表達具有上調作用[16]。LEACH等[17]研究顯示，在原發性膀胱癌病人的膀胱沖洗液中hMSH2陽性表達增加。但也有一些研究結果顯示，在某些腫瘤組織中hMSH2基因表達減少或缺失，而hMSH2表達下調或缺失的腫瘤通常伴有微衛星不穩定性，微衛星的不穩定性反映了錯配修復系統的缺陷[18-19]。

本文的研究結果顯示，早期胃癌病人hMLH1和hMSH2的表達與其年齡、性別及腫瘤部位、組織學類型、浸潤深度、分化程度等無關。既往有研究顯示，消化系統惡性腫瘤中MMR基因表達與病人的年齡、性別及腫瘤部位、組織學類型、浸潤深度、分化程度、腫瘤分期、有無淋巴結轉移等無關[4,20]。但也有研究表明，不同性別、年齡結腸癌病人hMLH1基因甲基化表達存在差異，并且其表達呈增加趨勢，導致hMLH1基因表達減少[21]。

本文研究結果還顯示，早期胃癌組織hMLH1基因表達明顯低于癌前病變組織及慢性胃炎組織，表明hMLH1的高表達在一定程度上可能會抑制DNA突變或損傷所造成的細胞惡變趨勢，進而抑制惡性腫瘤的發生。hMLH1在執行錯配修復時與hPMS2構成異源二聚體hMutLα，具有提高與錯配修復基因結合效率的功能[22]。hMLH1表達下調的原因，可能是基因突變引起的表達缺失，而更可能的是因為啟動子區域甲基化。hMLH1表達下調導致錯配修復效率下調，造成突變的累積及腫瘤的發生。一般認為，慢性萎縮性胃炎、低級別上皮內瘤變是胃癌發生發展中的一個階段。本研究癌前病變組與慢性胃炎組相比，hMLH1基因表達減少，但差異無統計學意義，這可能在一定程度上預示病變進一步發展，最終可能發生胃癌。既往某些研究結果與本文結果相似，BAEK等[23]研究顯示，大部分胃癌病人可見hMLH1表達缺失或減少；PEIRO等[24]研究顯示，子宮內膜癌病人MLH1表達缺失。

既往認為Hp感染導致胃癌一般遵循從慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、不典型增生到胃癌的演變過程[1]。一般認為，Hp侵襲胃黏膜引起的慢性炎癥可導致大量氧自由基的產生，部分代謝產物為基因毒性物質[25]。本文結果顯示，Hp感染組早期胃癌組織hMLH1、hMSH2陽性表達率顯著低于非Hp感染組，而Hp感染組癌前病變和慢性胃炎組織hMLH1、hMSH2陽性表達率與非Hp感染組比較差異無顯著意義，但是表達水平存在下降的趨勢，提示Hp感染可能對hMLH1、hMSH2表達有影響，其機制目前不明確。有研究結果表明，向胃黏膜培養細胞液中加入Hp后，hMLH1和hMSH2的表達均有所下降[26]。

綜上所述，在慢性胃炎、癌前病變、早期胃癌的疾病發展過程中，hMSH2基因表達增加，hMLH1基因表達減少。Hp感染可能通過影響hMSH2和hMLH1基因表達，影響早期胃癌的發生。但仍有許多問題，如慢性萎縮性胃炎、癌前病變、早期胃癌與MMR家族其他修復基因的關系等，今后需要進一步研究。

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(本文編輯 馬偉平)

THE EXPRESSIONS AND SIGNIFICANCE OF HMLH1 AND HMSH2 IN EARLY GASTRIC CANCER

JUHui,LIUXishuang,XIADi,LIUHua,ZHANGCuiping,JIANGYueping

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expressions of hMLH1 and hMSH2 proteins in mucous membrane of early-stage gastric cancer and their significance.MethodsSamples from 45 cases of early gastric cancer resected through endoscopic surgery, and 38 cases of premalignant lesions were collected, and 42 cases of chronic gastritis confirmed by gastroscopic biopsies were collected as well. The expressions of hMLH1 and hMSH2 in three kinds of the tissues were detected using Western blotting.ResultsThe expression of hMLH1 in chronic gastritis and precancerous lesions was higher than that in early gastric cancer, the difference was statistically significant (F=9.578,P<0.05); the expression of hMSH2 in early gastric cancer was higher than that in chronic gastritis and precancerous lesions (F=32.952,P<0.05). The expressions of hMLH1 and hMSH2 protein in early gastric cancer were not correlated with patient’s age and sex, location and size of tumor, depth of infiltration and histological type (P>0.05). The positive rate of hMSH2 in early gastric cancer infected with Hp was lower than that in non-Hp-infected (χ2=22.361,P<0.05), the expression of hMSH2 in precancerous lesions and chronic gastritis was also lower than that in non-Hp-infected group, but the difference was not statistically significant (P>0.05).ConclusionIn the development process from chronic gastritis to precancerous lesions to early gastric cancer, the expression of hMSH2 increases and that of hMLH1 decreases. Hp infection impacts the occurrence of early gastric cancer probably through affecting the expressions of both hMSH2 and hMLH1.

stomach neoplasms; precancerous conditions; DNA mismatch repair;Helicobacterpylori

2015-03-11;

2015-06-05

鞠輝(1980-)，男，博士研究生，主治醫師。

劉希雙(1964-)，男，博士，主任醫師，博士生導師。

R735.2

A

1008-0341(2015)04-0415-04