奧沙利鉑并大劑量照射對大鼠直腸近期生物學效應

陳曉曼，安永恒，張碧媛，陳明璇

(青島大學附屬醫院腫瘤科，山東 青島 266003)

?

奧沙利鉑并大劑量照射對大鼠直腸近期生物學效應

陳曉曼，安永恒，張碧媛，陳明璇

(青島大學附屬醫院腫瘤科，山東 青島 266003)

目的 了解奧沙利鉑并大劑量X線盆腔照射對正常大鼠直腸組織的損傷。方法 將120只Wistar大鼠隨機分成A、B、C、D組，D組給予腹腔注射生理鹽水及假照,A組腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg,B組盆腔給予6 MV X線12 Gy單次大劑量照射；C組腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg聯合6 MV X線12 Gy單次大劑量照射。照射后第3、7、14、21、42天，各組分別處死6只大鼠，觀察直腸組織的形態學改變，免疫組織化學法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達情況。結果 C組大鼠照射后第7天直腸杯狀細胞大量減少，固有層腺體萎縮，黏膜下可見大量的炎細胞浸潤及纖維化形成；A、B組出現類似癥狀，程度較輕。A、B、C組各時間點的Bax表達陽性率比較差異均有顯著性，其中第14、21、42天Bax表達陽性率較第3、7天降低，差異有顯著性(F=129.1～550.8，P<0.01)。A、B、C組照射后的第3、7天Bax表達陽性率較D組明顯升高，其中C組Bax表達陽性率均較同期的A、B組高，差異有顯著性(F=596.9、134.8，P<0.01)。A、B、C組各時間點的Bcl-2表達陽性率比較差異均有顯著性，3組第7天時表達率低于其他時間點(F=199.3～548.2，P<0.01)；C組Bcl-2表達陽性率較同期的A、B、D組低(F=25.9，P<0.01)。隨著時間延長，C組Bcl-2表達陽性率呈一定的上升趨勢，第14、21、42天均較第7天升高，差異有顯著性(F=548.2，P<0.01)。結論 同期放化療對直腸組織損傷較單純化療、單純放療嚴重，后期出現代償性修復的機制可能與Bax、Bcl-2表達的變化有關。

輻射損傷；直腸；細胞凋亡；放化療,輔助

同期放化療可以明顯提高腫瘤局部控制率、病人遠期生存率，但與單一放療或化療相比，同期放化療能造成放射區域組織的損傷加重，出現不同程度的并發癥。尤其是在腹盆腔惡性腫瘤的放射治療中，直腸常常受到照射，出現難以耐受的損傷。作為早反應組織之一，直腸對于分割劑量較為敏感，病人常因急性放射性直腸炎不能耐受而中斷治療，影響療效。因此，預防放射性直腸炎的發生不容忽視。目前關于同期放化療后正常直腸組織損傷的基礎研究尚少。本實驗通過動物實驗，觀察奧沙利鉑聯合單次大劑量照射盆腔后直腸組織形態學及相應指標變化，為同期放化療直腸正常組織的保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雌性Wistar大鼠120只，清潔級，體質量為(250±20)g，由青島市藥檢所提供。籠內飼養，自然光照，室溫16～20 ℃，標準飼料喂養，自由飲水。隨機分為A、B、C、D組，每組30只。

1.2 實驗試劑及儀器

試劑：Bcl-2鼠抗人單克隆抗體、Bax兔抗人多克隆抗體等，購自青島云山生物科技有限公司；蘇木精、伊紅、戊二醛等由青島市市立醫院病理科提供。儀器：美國瓦里安23EX直線加速器；自制大鼠固定器等。

1.3 實驗方法

A組大鼠腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg；B組大鼠給予6 MV X線12 Gy一次性照射大鼠盆腔；C組大鼠先給予腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg，后給予6 MV X線 12 Gy一次性照射大鼠盆腔；D組腹腔注射等量生理鹽水并行假照。需要放療的大鼠腹膜腔內注射體積分數為0.10的水合氯醛麻醉，置于自制木板固定器上，模擬機下定位確定照射范圍：上界為恥骨聯合，下界為肛門口，左右界開放，射野面積 3 cm×4 cm，定位后將大鼠置于加速器下，應用6 MV X線 12 Gy一次性照射大鼠盆腔，源皮距為80 cm。各組大鼠分別在照射后的第3、7、14、28、42天深度麻醉處死，每次6只。

1.4 直腸組織形態學觀察

剖取距肛門以上3 cm的直腸組織，肉眼觀察大體形態。沿縱軸剪開，使用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)清洗干凈，取大小約1 cm×1 cm組織，用甲醛溶液固定，常規脫水、透明、包埋，石蠟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。由3位經驗豐富的病理科醫生共同評價大鼠直腸腺體的變化情況。評價標準：腺體正常，0分；腺體減少<25%，1分；腺體減少25%～49%，2 分；腺體減少50%～74%，3分；腺體減少75%～100%，4 分。

1.5 Bcl-2和Bax蛋白表達檢測

采用S-P法[1]染色觀察直腸組織中Bcl-2與Bax蛋白的表達。細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒即為陽性。400倍光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取10個高倍視野,每個視野計數200個細胞,共2 000個細胞,計算陽性細胞的百分數[2]。Bcl-2(Bax)表達陽性率=Bcl-2(Bax)陽性細胞數/計數細胞總數×100%。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組一般狀況

A組大鼠較為活躍，進食量稍有下降，5 d后飲食量逐漸回升，未見稀便、黏液膿血便。B組大鼠照射后進食飲水量未見明顯變化，3 d后進食量下降，少動，部分大鼠肛門口紅腫充血，少量黏液便。C組大鼠照射后進食飲水量減少，甚至完全拒絕進食飲水，消瘦明顯，反應遲鈍，腹部凹陷，少量稀便、黏液便、膿血便，尿道口潮濕，肛門周圍潮紅、不潔；照射后28 d存活大鼠照射野脫毛，活動、進食飲水量減少。D組大鼠飲食排便正常，活動靈敏，毛色正常，體質量逐漸增加。

2.2 大鼠直腸組織病理學觀察

光鏡下觀察可見，第7天時各實驗組大鼠直腸組織病理學變化最為明顯：C組大鼠直腸杯狀細胞大量減少，固有層腺體萎縮，排列稀疏，黏膜下可見大量炎細胞浸潤及纖維化形成；B組大鼠直腸黏膜及黏膜下組織輕度充血和少量炎細胞浸潤，杯狀細胞減少，腸管輕度擴張充血；A組大鼠直腸黏膜上皮和腺體結構基本完整，無明顯細胞變性和炎細胞浸潤。D組大鼠直腸黏膜結構完整，腺體排列整齊。

2.3 各組直腸腺體變化評分比較

第7天時A、B、C、D組大鼠直腸腺體變化評分分別為2.10±1.03、2.77±1.24、3.32±0.52、0，A、B、C組大鼠直腸腺體變化評分高于D組，C組高于A組，差異有顯著性(F=17.579，P<0.05)；C組與B組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 各組Bax表達比較

析因設計的方差分析結果顯示，Bax表達組別與時間因素存在交互作用(F=122.6，P<0.01)。A、B、C組各時間點Bax表達陽性率比較差異均有顯著性(F=129.1～550.8，P<0.01)。D組各時間點Bax表達陽性率差異無顯著性(P>0.05)。A、B、C組照射后的第3、7天Bax表達陽性率較D組明顯升高，第7天升高更為明顯，差異有顯著意義(F=188.6～596.9，P<0.01)，其中C組Bax表達陽性率較同期的A、B組高(q=15.0～64.9，P<0.01)。A、B、C組第14、21、42天Bax表達陽性率較第3、7天降低，差異有顯著性(F=25.2～134.8，P<0.01)。見表2。

2.5 各組Bcl-2表達比較

析因設計的方差分析顯示，Bcl-2表達組別與時間因素存在交互作用(F=118.5,P<0.01)。A、B、C組各時間點的Bcl-2表達陽性率比較差異均有顯著性，其中第7天時表達率低于其他時間點(F=199.3～548.2，P<0.01)；各時間點D組的Bcl-2表達陽性率比較差異無顯著性(P>0.05)。C組第7天時Bcl-2表達陽性率較A、B、D組低(F=25.9，q=4.6～14.5，P<0.01)。隨著時間延長，C組Bcl-2表達陽性率呈一定的上升趨勢，第14、21、42天表達陽性率均較第7天明顯升高，差異有顯著性(F=18.5～472.4，P<0.01)。見表3。

表2 各組不同時間點Bax蛋白表達陽性率比較

表3 各組不同時間點Bcl-2蛋白表達陽性率比較

3 討 論

放療同期聯合化療因能提高腫瘤控制率、提高治療效果而成為目前治療惡性腫瘤的常用方法。直腸癌位居我國腫瘤發病率第3位，術前同期放化療可以降低腫瘤分期，提高直腸癌保肛率及局部腫瘤控制率[3]，已成為有適應證直腸癌的規范治療方法。宮頸癌是女性發病率第2位的癌癥，每年新發病例約50萬，占所有新發癌癥病例的5%[4]，鉑類化療聯合放療可以達到局部腫瘤降期、提高病人生存率的目的，是目前應用最廣泛的綜合性療法。直腸的解剖位置固定，與腹盆腔臟器關系緊密，在治療腹盆腔惡性腫瘤時通常不可避免地進入到射野區域內，受到X線的損傷[5]，發生急性放射性直腸炎。病人難以耐受，生活質量下降，甚至被迫中斷治療，嚴重影響了放射治療的進程和療效[6]。傳統的放療模式每次照射腫瘤的劑量為1.5～2.0 Gy，每天1次，每周5次，而大分割照射是通過增加單次放療的分割劑量從而減少放療分割次數，最終達到更為有效生物劑量，最大程度殺滅腫瘤細胞，同時減少放療次數，使病人易于接受。與此同時，大分割放射線也造成了對直腸組織的損傷，急性放射性直腸炎通常始于放療后1～2周，當直腸照射劑量>50 Gy時，放射性直腸炎的發生率明顯提高[7]。直腸接受輻射后黏膜上皮可出現急性損傷，表現為充血水腫，腺體萎縮減少，腸黏膜通透性增加，破壞正常腸屏障免疫功能，造成細菌移位于腸內形成膿毒血癥。李宜放等[8]研究顯示，照射后正常直腸黏膜出現炎性改變，杯狀細胞減少，腸上皮萎縮，黏膜及黏膜下炎性細胞滲出、嗜酸性粒細胞浸潤,黏膜下層血管內皮可見大量充血水腫及纖維化。本研究光鏡下顯示，與其他組比較，同期放化療組大鼠在第7天時直腸黏膜上皮細胞水腫較明顯，腺上皮杯狀細胞數目減少，炎性細胞浸潤較多，固有層腺體萎縮明顯，腺體減少嚴重，黏膜下可見大量炎細胞浸潤及纖維化形成明顯，與相關研究結果相符。提示同期放化療后發生急性放射性直腸炎的程度較為嚴重，對直腸的損傷較重。

已有研究表明，奧沙利鉑對結直腸癌細胞株及順鉑耐藥的細胞株有顯著抑制作用，且臨床用藥不良反應較輕[9]。在直腸癌治療中應用奧沙利鉑有放療增敏作用。放化療引起細胞損傷的作用機制主要是通過堿基破壞、單鏈斷裂及雙鏈斷裂引起的細胞DNA損傷而實現，從而激活細胞凋亡。調節細胞凋亡過程關鍵是Caspase家族級聯激活而引發的細胞崩解。其中，Bcl-2家族是對Caspase家族的級聯激活進行調控的一類重要因子[10]。凋亡抑制基因bcl-2與凋亡誘導基因bax的比率(bcl-2/bax)是調控細胞凋亡的關鍵。當其比值升高，抑制細胞凋亡；比值下降，促進細胞凋亡。正常直腸組織中Bcl-2蛋白主要表達于陷窩基底部，表皮上皮細胞表達較少；Bax蛋白主要在直腸黏膜上皮的胞漿及胞膜中表達，基底細胞表達較少。這種表達分布對于維持陷窩基底細胞的增殖、表皮細胞的死亡脫落、正常黏膜的新陳代謝功能有重要意義。本研究結果表明，在接受照射后的一段時間內，同期放化療組正常直腸組織的損傷程度較單純放療組及單純化療組嚴重，其機制可能與同期放化療引起的細胞損傷誘發細胞凋亡，直腸組織細胞中Bax蛋白表達陽性率逐漸升高，Bcl-2蛋白表達陽性率逐漸降低有關；隨著時間延長，Bax蛋白表達陽性率開始下降，Bcl-2蛋白表達陽性率逐漸升高，其機制可能與細胞損傷后發生代償性修復，使凋亡蛋白表達減少，抗凋亡蛋白表達升高，抑制凋亡有關。

綜上所述，奧沙利鉑聯合大劑量放療后大鼠正常直腸組織初始急性損傷較單純放療組及單純化療組嚴重，可能與同步放化療后凋亡相關蛋白的變化有關。后期出現代償性修復，提示對于臨床上身體潛力大、無糖尿病等的病人可以考慮選擇同期放化療。但要進一步明確直腸組織損傷發展變化過程與細胞凋亡相關蛋白表達的關系以及臨床效果，還需進一步的基礎研究和臨床驗證。

[1] 楊愛潔,何信佳,安永恒,等. 單次大劑量X 線照射對大鼠胰腺的損傷作用[J]. 齊魯醫學雜志, 2011,26(4):316-318.

[2] 呂紅春,安永恒,何信佳,等. 奧沙利鉑聯合單次大劑量照射對大鼠胰腺的放射損傷[J]. 齊魯醫學雜志, 2013,28(3):207-210.

[3] 孫文潔,章真. 直腸癌放射治療的現狀與研究熱點[J]. 中國癌癥雜志, 2013,23(6):476-480.

[4] 程海燕,楊秀鳳,馬會清. 宮頸癌介入化療前后SDF-1和CXCR4表達及意義[J]. 齊魯醫學雜志, 2015,30(2):135-137.

[5] PIRONI D, PANARESE A,VENDETTUOLI M, et al. Chronic radiation-induced proctitis: the 4% formalin application as non-surgical treatment[J]. Int J Colorectal Dis, 2013,28(2):261-266.

[6] BUDAUS L, BOLLA M, BOSSI A, et al. Functional outcomes and complications following radiation therapy for prostate cancer: critical analysis of the literature[J]. Eur Urol, 2012,61(1):112-117.

[7] 丁云霞. 放射性直腸炎的預防與治療[J]. 國外醫學:腫瘤學分冊, 2001,5(2):394-396.

[8] 李宜放,劉麗坤,王晞星,等. 直線加速器誘發大鼠急性放射性直腸炎模型的建立與評價[J]. 現代腫瘤學, 2009,24(3):602-604.

[9] 殷蓓蓓,梁軍,谷建,等. 晚期結直腸癌GSTP1基因多態性與奧沙利鉑化療效果關系[J]. 齊魯醫學雜志, 2009,24(3):192-195.

[10]丁威利,隋愛華,劉世海,等. 大氣壓冷等離子體射流誘導乳癌細胞凋亡研究[J]. 齊魯醫學雜志, 2013,28(4):305-307.

(本文編輯 黃建鄉)

SHORT-TERM BIOLOGICAL EFFECT OF OXALIPLATIN COMBINED WITH A SINGLE LARGE-DOSE RADIATION ON RECTUM OF RATS

CHENXiaoman,ANYongheng,ZHANGBiyuan,CHENMingxuan

(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the damage of normal rectum in rats caused by oxaliplatin combined with a single large-dose of radiation.MethodsA total of 120Wistarrats were equally randomized to four groups as groups A, B, C and D. The rats in group D were intraperitoneal injection of normal saline and pseudo radiation; those in group A were intraperitoneal injection of oxaliplation (15 mg/kg); those in group B were given 6 MV X-ray at single dose of 12 Gy irradiating on pelvic cavity; and those in group C received 6 MV X-ray at a single dose of 12 Gy irradiating pelvic cavity after intraperitoneal injection of 15 mg/kg oxaliplation. Six rats in each group were killed in each time on days 3,7,14,21 and 42 after radiation. Morphological changes were observed by HE staining. Expressions of Bcl-2 and Bax were examined using immunohistochemical technique.ResultsOn day 7 after radiation, the goblet cells in rectum of rats in group C markedly decreased, glands in lamina propria atrophied, and a large quantity of submucosal inflammatory cellular infiltration and fibrosis could be seen, similar reactions were also observed in groups A and B, but slighter. Expressions of Bax were significantly different between each time point of groups A, B and C, of which, the expressions on days 14, 21 and 42 were lower than that on days 3 and 7 (F=129.1-550.8,P<0.01). On days 3 and 7 after radiation, the expression of Bax in groups A, B and C was elevated compared with group D, of which, the expression of Bax in group C was higher than that in groups A and B of corresponding time (F=596.9，134.8;P<0.01). The difference of expression of Bcl-2 in groups A, B and C between different time points was significant, the expression rate of the three groups on day 7 was lower than the other time points (F=199.3-548.2,P<0.01). The positive expression rate of Bcl-2 in group C was lower than groups A, B and D of the same time period (F=25.9,P<0.01). Along with the extension of time, there was a tendency of unvarying elevation of Bcl-2 expression, being higher on days 14,21 and 42 than that on day 7 (F=548.2,P<0.01).ConclusionConcurrent chemoradiotherapy may cause more severe damage than merely radio-or chemotherapy do in rectal tissue of rats. The presence of compensatory and repair in later stage is probably associated with the changes of expressions of Bax and Bcl-2.

radiation injuries; rectum; apoptosis; chemoradiotherapy, adjuvant

2015-01-20;

2015-05-05

陳曉曼(1987-)，女，碩士研究生。

安永恒(1961-)，男，主任醫師，教授，碩士生導師。

R818.8

A

1008-0341(2015)04-0386-04