“二仙湯”對人乳腺癌HCC1937細胞侵襲的影響

顧 淵，石坤和，高 瑛，李 夏，李 寧，唐曉丹，楊新偉，王開強

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移是治療失敗和患者死亡的主要原因。中醫(yī)學認為沖任失調(diào)是發(fā)生乳房疾病最主要的致病因素之一，也是乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要病機。臨床上“調(diào)攝沖任”治則法能明顯改善乳腺癌術后患者的預后，減少腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究就“二仙湯”經(jīng)典方劑的抗乳腺癌HCC1937細胞轉(zhuǎn)移進行了體外實驗研究?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及實驗動物

細胞HCC1937為人乳腺癌細胞株，購自中國科學院細胞庫。SD雌性大鼠，購自中國科學院實驗動物處。

1.2 儀器設備

CO2培養(yǎng)箱，RTCA×CELLigence DP系統(tǒng)，CIM Plate 16檢測板，垂直電泳槽購自biorad生物公司;垂直電轉(zhuǎn)移槽購自biorad生物公司。

1.3 藥物及試劑

“二仙湯”的配方:由仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母、莪術組成，由上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，并制成含生藥量6 g的流浸膏。5-氟尿嘧啶(5-FU)醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，蒸餾水配制成15 mg/ml。RPMI1640購自凱基生物公司，F(xiàn)BS購自Gibico生物公司，1%Penicilline-Streptomycin solution購自Gibico生物公司，0.25%/Trypsin/EDTA solution購自Gibico生物公司，PBS購自Hyclone生物公司，蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司，BCA蛋白定量試劑盒購自凱基生物公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清，在37℃和5%CO2充分濕化條件下培養(yǎng)備用。參照文獻［1］。

1.4.2 動物分組及藥物血清制備 SD雌性大鼠60只，分為“二仙湯”治療組、5-FU組、空白對照組，每組20只。大鼠給藥劑量為人等效劑量的5倍，即“二仙湯”31 g/(kg·d)(生藥量)，5-FU 100 mg/(kg·d)?！岸蓽敝委熃M按10 ml/kg確定灌胃劑量，早晚各灌胃1次;5-FU組按腹腔注射給藥，早晚各1次;空白對照組以等體積生理鹽水灌飼。連續(xù)給藥3 d后，當夜禁食不禁水，第4天再給藥1次(1 d量)。二仙湯治療組和空白對照組在末次給藥后1.5～2 h腹主動脈采血，5-FU組末次給藥后6 min腹主動脈采血。無菌條件下分離血清，同組混合以消除個體差異，45 μm微孔濾膜過濾除菌，56℃，30 min水浴滅活，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 “二仙湯”藥物血清對體外細胞侵襲能力的影響 (1)在超凈臺內(nèi)將檢測板上室與下室從包裝中取出，放在超凈臺上，使藍色標志點位于夾具的左上方，將下室平穩(wěn)地放到夾具對應的凹槽中。(2)下室的孔中加入165 μl培養(yǎng)基，注意加液時不要產(chǎn)生氣泡，使加入的培養(yǎng)基在下室的孔內(nèi)形成凸出的彎月面。(3)將夾具連同下室沿逆時針旋轉(zhuǎn)90°，將上室中傳感器一面置于下室上，注意使上室與下室的孔對齊。放置時注意上、下室貼有藍點的孔相對應，放置時要避免氣泡的產(chǎn)生。將上室放到下室上之后，立即用手向下按壓，可聽到2次卡扣卡入的聲音。(4)在上室中加入30 μl無血清培養(yǎng)基，輕拍板的四周，使培養(yǎng)基分布均勻。置于37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中平衡1 h。(5)制備細胞懸液:細胞株在進行細胞遷移實驗前一天進行細胞傳代，使細胞飽滿度在60% ～80%之間。從培養(yǎng)箱中取出細胞，消化離心后，用無血清培養(yǎng)基配制成實驗需要的細胞濃度為7×105個/ml。(6)將測好基線的板取出，在上室孔中加入100 μl混合均勻的無血清細胞懸液，使每孔中細胞數(shù)為70 000個。然后將板置于超凈臺中室溫放置30 min后，進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

“二仙湯”治療組與5-FU組、空白組生理鹽水組相比均有抑制HCC1937細胞體外侵襲的作用(P＜0.05)，其中以“二仙湯”治療組作用最為顯著，5-FU組無作用。見圖1。

圖1 各藥物血清對體外人乳腺癌HCC1937細胞侵襲的影響

3 討論

乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要標志，也是導致患者死亡的主要原因。存在于癌細胞內(nèi)部Cdc42蛋白是癌細胞轉(zhuǎn)移所需的關鍵蛋白，是癌細胞內(nèi)皮細胞相互作用和跨內(nèi)皮細胞遷移的關鍵調(diào)節(jié)者［2］。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種蛋白能夠幫助癌細胞依附于血管壁上，從而使它們通過血液擴散到身體的其他部位。Cdc42蛋白基因在調(diào)節(jié)細胞骨架、細胞運動、細胞凋亡、細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用［3］。抑制Cdc42蛋白，癌細胞便無法再依附于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞上，從而減少其擴散的機會。以Cdc42蛋白為抑制靶點，或?qū)⒊蔀轭A防癌癥轉(zhuǎn)移的有效方法。

中醫(yī)學認為，乳房的生理、病理直接受沖任二脈經(jīng)氣盈虧的調(diào)節(jié)。沖任失調(diào)是乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素?！岸蓽笔钦{(diào)攝沖任的經(jīng)典代表方，由仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母、莪術組成。方中靈脾、仙茅、巴戟天能溫腎助陽、充盈沖任;當歸、黃柏、知母、莪術能疏肝活血以調(diào)沖任。該方可從根本上調(diào)整體內(nèi)陰陽平衡。動物實驗表明，以“二仙湯”為基本方的乳寧方對DMBA誘導的大鼠乳腺癌模型無論是啟動期還是促癌期均有抑制作用［4］。臨床應用研究發(fā)現(xiàn)以“二仙湯”為基礎的中藥方劑對乳腺癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，能提高患者無瘤生存和遠期存活率［5］。

本實驗表明以調(diào)節(jié)沖任失調(diào)的代表方劑“二仙湯”能改善乳腺癌患者的預后，抑制乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移。但“二仙湯”究竟是如何影響抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移，具體機制還有待進一步的研究。

［1］ Ding J，Huang S，Wu S，et al.Gain of miR-151 on chromosome 8q24.3 facilitates tumour cell migration and spreading through downregulating RhoGDIA［J］.Nat Cell Biol，2010，12:390-399.

［2］ Reymond N，Im JH，Garg R，et al.Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin［J］.J Cell Biol，2012，199(4):653-668.

［3］ Emeline C，F(xiàn)lorent P，Sanson M.N-cadherin expression level modulates integrin-mediated polarity and strongly impacts on the speedand directionality of glial cell migration［J］.J Cell Sci，2011，125(4):844-857.

［4］ 薛曉紅，劉勝，楊新偉，等.乳寧沖劑及拆方對裸鼠移植瘤生長及肺轉(zhuǎn)移的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39(7):45-47.

［5］ 陳光群，黃振步，黃志有.乳復寧2號治療乳腺癌Ⅱ-Ⅲ期術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床研［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2009，33(3):334-335.