川芎嗪對實驗性肝纖維化大鼠肝組織中細胞自噬的影響

張海娟 徐軍全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞強

·實驗研究·

川芎嗪對實驗性肝纖維化大鼠肝組織中細胞自噬的影響

張海娟 徐軍全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞強

目的 研究川芎嗪對肝纖維化時肝組織中細胞自噬的影響及其可能的機制。方法 32只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組10例、肝纖維化模型組11例、川芎嗪治療組11例, 以四氯化碳(CCL4)皮下注射復制大鼠肝纖維化模型, 川芎嗪治療組在復制肝纖維化模型過程中同時給予川芎嗪皮下注射， 對照組給予等體積的植物油代替CCl4, 等體積的生理鹽水代替川芎嗪注射液。6周后處死動物, 測定血漿內毒素和肝組織羥脯氨酸、丙二醛(MDA)及LC3B蛋白含量, 免疫組織化學法觀測LC3B蛋白在肝組織中的分布情況。結果 肝纖維化時肝組織LC3B的含量明顯升高, 主要分布于肝竇周隙細胞, 且LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值與血漿內毒素水平的升高呈正相關；川芎嗪治療組LC3B表達明顯減弱, 尤其是肝竇周隙細胞。結論 川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低血漿內毒素、肝星狀細胞(HSC)自噬有關。

肝纖維化； 內毒素；自噬；川芎嗪

細胞自噬是當前生物醫學界熱點研究領域之一, 近年來有不少研究報道提示細胞自噬(autophagy)與肝纖維化之間也存在著密切的關系［1,2］, 干預肝組織中的細胞自噬可能會成為一個新的抗肝纖維化治療靶點。川芎嗪是從活血化瘀類中藥川芎中分離提純的一種生物堿單體, 實驗研究表明川芎嗪具有良好的抗肝纖維化作用［3］, 但其具體作用機制尚不明確。本實驗初步觀察肝纖維化過程中細胞自噬現象及川芎嗪治療對自噬的影響, 進一步研究川芎嗪抗肝纖維化的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級健康SD大鼠32只, 平均體重(200±20)g, 購買自山西醫科大學實驗動物中心, 隨機分為正常對照組10例、肝纖維化模型組11例、川芎嗪治療組11例。

1.2 動物模型制備 采用CCl4皮下注射建造大鼠肝纖維化模型, 肝纖維化模型組和川芎嗪治療組首次皮下注射分析純CCl45 ml/kg , 之后按3 ml/kg皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液, 2次/周, 川芎嗪治療組于造模的同時給予60 mg/kg腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液, 6次/周, 正常對照組給予等體積的植物油代替CCl4, 等體積的生理鹽水代替川芎嗪注射液。

1.3 取材 于造模6周時, 乙醚麻醉大鼠, 無菌無熱原技術條件下腹主動脈采血取血漿, 取肝左葉左半部于4%多聚甲醛中固定, 常規石蠟包埋4 μm切片；其余部分液于-86℃冰箱保存備用。

1.4 主要試劑與方法 兔源LC3B多克隆抗體, 購自美國SIGAM公司(批號L7543), 二抗為羊抗兔抗體, 購自北京中杉金橋有限公司, β-actin一抗及二抗均購自北京中杉金橋有限公司。顯色基質偶氮法鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司, 天狼猩紅、固綠購自Sigma公司, MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鹽酸川芎嗪注射液購自鄭州卓峰制藥有限公司。肝組織膠原染色及羥脯氨酸(HYP)含量測定參照本實驗室以往的方法［3］；血漿內毒素及肝組織MDA含量測定依照試劑盒說明書操作；Western Blot測定組織LC3B蛋白的表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson法。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LC3B免疫組織化學染色顯示 正常對照組大鼠的肝組織僅有少量的LC3B表達；肝纖維化模型組大鼠肝細胞胞漿及胞核中LC3B表達陽性顆粒表達顯著增加, 主要分布于肝竇周隙細胞；川芎嗪治療組較肝纖維化模型組肝細胞胞漿及胞核中LC3B的陽性顆粒明顯減少, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 血漿內毒素含量及肝損傷、肝纖維化指標 肝纖維化模型組血漿內毒素及肝組織中HYP、MDA的含量均較正常對照組明顯升高(P＜0.01), 而川芎嗪治療組均明顯降低, 形態學觀察與膠原染色也明顯改善。見表1。

2.3 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的變化 正常對照組LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ的比值最低, 肝纖維化模型組隨著內毒素濃度的增加, LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值逐漸增高, 川芎嗪治療組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值較肝纖維化組低, 但仍明顯高于正常對照組(P＜0.05)。見表1。血漿內毒素與肝組織LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ表達呈正相關(r=0.87, P＜0.05)。

表1 各組大鼠血漿內毒素(ET)和肝組織HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比較

表1 各組大鼠血漿內毒素(ET)和肝組織HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比較

注： 與正常對照組比較,aP＜0.01,bP＜0.05；與肝纖維化模型組比較,cP＜0.01,dP＜0.05

組別例數ETHYPMDALC3BⅡ/Ⅰ正常對照組100.22±0.040.08±0.15 2.31±0.571.02±0.32肝纖維化模型組11 0.78±0.29a0.35±0.19a14.86±2.11a1.93±0.27川芎嗪治療組11 0.41±0.08b0.19±0.09c4.86±0.95c1.53±0.14d

3 討論

近年來, 肝纖維化的研究日益深入, 許多觀念得到更新,但HSC的活化仍然是公認的關鍵環節［4］。實驗證明, HSC的活化過程與細胞自噬的發生有關, 細胞自噬可促進HSC的活化, 進而促進肝纖維化［1,2］。細胞自噬是一種降解細胞內的長壽蛋白質和受損的細胞器維持細胞內平衡的代謝過程。LC3B蛋白是常用的細胞自噬的標志分子, 有Ⅰ、Ⅱ型之分,未發生自噬時, 細胞內合成的LC3B先成為胞漿可溶性的LC3B-Ⅰ；當細胞自噬發生時, LC3B-Ⅰ經加工修飾與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3B-Ⅱ。其含量與自噬泡數量成正比, LC3B-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可估計自噬水平的高低。

川芎嗪在治療肝纖維化中取得了較好的效果, 以往認為其主要機制和抗脂質過氧化、抗肝細胞損傷有關, 本室最近的研究也表明可能與其降低內毒素血癥, 激活肝內Nrf2/ARE抗氧化通路有關［3］。各種急慢性肝臟疾病常伴有腸源性內毒素血癥可促進肝纖維化的發生與發展, 但其機制尚不完全清楚。最新資料提示, 內毒素可通過TLR4信號通路誘導腹膜腔間皮細胞自噬［5］, 由此推測內毒素也可能通過TLR4信號通路誘導HSC自噬進而促進肝纖維化, 川芎嗪的抗纖維化作用也可能與其降低血漿內毒素進而降低HSC自噬有關。本實驗結果顯示, 川芎嗪在抗纖維化、降低血漿內毒素的同時,肝組織細胞自噬也明顯減輕, 而且LC3B-Ⅱ/Ⅰ與血漿內毒素水平呈明顯的正相關。

綜上所述, 川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低血漿內毒素、肝星狀細胞自噬現象有關。進一步的因果關系及其機制有待下一步的離體細胞培養實驗證實。

［1］ Song, Y, Zhao, Y, Wang, F.et al.Autophagy in hepatic fibrosis.Biomed Res Int, 2014:436-442.

［2］ Hernandez-Gea, V, Friedman, S L.Autophagy fuels tissue fibrogenesis.Autophagy, 2012, 8(5):849-850.

［3］ 戚紅丹.川芎嗪對大鼠肝纖維化膠原干預及肝細胞基因譜影響的研究.北京中醫藥大學, 2007.

［4］ Puche, J E, Saiman, Y, Friedman, SL.Hepatic stellate cells and liver fibrosis.Compr Physiol, 2013, 3(4):1473-1492.

［5］ Wang, J, Feng, X, Zeng, Y, et al.Lipopolysaccharide (LPS)-induced autophagy is involved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelial cells.BMC Microbiol, 2013(13):255.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.18.191

2015-03-20］

030001 山西醫科大學(張海娟)；山西醫科大學汾陽學院(徐軍全 康杰 宋彬妤 姚瑞強 王明亮)

徐軍全