激光掃描共聚焦顯微鏡檢測分枝桿菌與溶酶體融合的實驗教學設計

喬 可, 王晴嵐, 牛 辰

(復旦大學 基礎醫學院病原生物學系，教育部、衛生部醫學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032)

激光掃描共聚焦顯微鏡檢測分枝桿菌與溶酶體融合的實驗教學設計

喬 可, 王晴嵐, 牛 辰

(復旦大學 基礎醫學院病原生物學系，教育部、衛生部醫學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032)

介紹了使用經綠色熒光蛋白標記的海分枝桿菌侵染巨噬細胞,再利用激光掃描共聚焦顯微技術檢測分枝桿菌與巨噬細胞溶酶體融合的實驗教學設計。該實驗對研究分枝桿菌與巨噬細胞的相互作用以及分枝桿菌的致病機制具有重要意義,同時在教學實驗中使學生更深入地理解激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術,并培養學生的實踐能力和科研創新意識。

激光掃描共聚焦顯微鏡； 綠色熒光蛋白； 分枝桿菌； 巨噬細胞

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)技術是生物醫學研究中最先進的熒光成像和細胞分析技術,它可在細胞、亞細胞水平上,對固定的或活的生物組織、細胞及其他微小物質進行形態和功能的分析,可連續獲取不同層面的光學切片,實現標本的三維重建,可在不損傷標本的情況下對標本的各個層面進行觀察。此外,它還可以對樣本進行動態觀察,實現時間序列掃描[1]。激光掃描共聚焦顯微技術是生物醫學學科研究生需要掌握的一項重要實驗技能,但作為生命科學領域中前沿的顯微成像技術是多學科發展的綜合成果,所涉及的物理學、電子學理論知識深奧繁瑣。因此,激光掃描共聚焦顯微技術實驗教學的內容設計應盡量讓學生在有限的課堂時間里形象、直觀地學習和掌握這門技術[2-4]。

分枝桿菌感染宿主后,主要寄生在宿主的巨噬細胞內,細菌在巨噬細胞內的生存狀態是被巨噬細胞的溶酶體清除,還是長期存活于巨噬細胞內,與其對宿主的感染能力直接相關[5]。此過程中的一個重要節點是分枝桿菌是否與溶酶體融合,它是細菌被巨噬細胞清除的重要步驟。巨噬細胞吞噬分枝桿菌后,形成吞噬小體,吞噬小體與細胞內一些內體融合,并逐漸酸化,最終與溶酶體融合,在溶酶體內的水解酶作用下清除細菌。然而,分枝桿菌進化出一系列的機制來抑制這一過程[6]。因此,直觀地觀察和分析分枝桿菌與巨噬細胞溶酶體的融合情況,對于研究分枝桿菌的致病機制及其與宿主的相互作用十分必要。本實驗教學設計采用經綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的海分枝桿菌(Mycobacterium marinum, Mm)侵染巨噬細胞,使用激光掃描共聚焦顯微技術檢測分枝桿菌與巨噬細胞溶酶體融合的狀況。本教學實驗涵蓋了激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術、GFP表達質粒轉化海分枝桿菌、海分枝桿菌感染巨噬細胞、免疫熒光標記技術等內容,做到實驗教學與科研設計相結合,為研究生在今后的科研工作中更好地使用該技術奠定了扎實的基礎。

1 實驗材料與儀器

(1) 菌株與細胞:海分枝桿菌M菌株(ATCCBAA-535)由美國Ramakrishnan L.博士1992年于加州大學舊金山分校Moffett醫院分離得到,由加拿大多倫多大學的劉軍教授饋贈。小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW264.7(ATCC TIB-71)購于中國典型培養物保藏中心CCTCC。含綠色熒光蛋白基因的pTEC15質粒由美國華盛頓大學的Ramakrishnan L.教授惠贈。

(2) 儀器與試劑:激光掃描共聚焦顯微鏡(leica SP8),DMEM培養基(Gibco),胎牛血清FBS(Gibco),抗Lamp1蛋白(Abcam),羊抗兔IgG(Abcam),DAPI(Invitrogen)。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

(1) 海分枝桿菌的培養。海分枝桿菌劃線于M7H10-10%OADC(DIFCO)培養皿上,30 ℃避光密封培養10 d后,挑取單個菌落接種于M7H9-10%OADC液體培養基中,30 ℃避光旋轉培養(100r/min)。營養添加物OADC,配制方法為0.6 g油酸(oleic acid,Sigma)、0.6 ml 6mol/L氫氧化鈉、50 g牛血清白蛋白組分V(Fisher)、20 g葡萄糖、8.5 g氯化鈉、30 mg觸酶,溶于1 L預冷的去離子水中,0.2 μm過濾避光保存于4 ℃。

(2) GFP表達質粒轉化分枝桿菌。制備海分枝桿菌的感受態細胞,然后將含GFP基因的pTEC15質粒電轉化到海分枝桿菌中。轉化條件為:電壓,2.5 kV；電容,25 μF；電阻,200 Ω；轉化時間,5.7 ms。

(3) 海分枝桿菌感染巨噬細胞。小鼠巨噬細胞株RAW264.7(ATCC no: TIB-71)培養于含10%FBS的DMEM+0.01mol/LHEPES培養基中,37 ℃培養到貼滿壁,胰蛋白酶消化后以1×105/well(5×105/well)濃度接種于0.17 mm玻璃底的直徑35 mm培養皿中,培養24 h。離心收集生長到對數早期的海分枝桿菌,用無菌玻璃珠將細菌打散,再加入7H9培養基重懸細菌,然后用5 μm Filter過濾獲得海分枝桿菌的單細菌懸液。CFU鋪板計數,剩余菌液-80 ℃保存備用。感染前,稀釋單細菌懸液于DMEM+10%胎牛血清白蛋白細胞培養液中,調整達到1×105CFU/ml,加入到經PBS清洗過的巨噬細胞培養皿中,32 ℃侵染2 h[7]。

(4) 免疫熒光標記溶酶體和細胞核。用3.7%～4%甲醛固定10 min,PBST洗2遍。用0.5%的Triton100通透5 min,PBST洗2遍。用1% BSA封閉30 min,PBST洗1遍。加入標記溶酶體的抗Lamp1蛋白抗體(一抗,1∶200),4 ℃孵育過夜,然后PBST洗3遍,每遍5 min。用羊抗兔l gG(二抗,1∶1 000,標記Aleax Flour 594)室溫孵育2 h,PBST洗3遍,每遍5 min。用DAPI染細胞核5 min,然后PBST洗3遍,每遍5 min[8]。

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測

(1) 儀器開機和檢測通道設置。先打開穩壓電源,依次打開顯微鏡、掃描器、激光開關,打開顯微鏡及金屬鹵素燈的電源。啟動Windows,啟動LASAF軟件。根據染料的激發波長選擇相應激光器。調節光電倍增管(PMT),選擇相應檢測范圍。本教學實驗采用3個通道進行檢測,其中第1通道激發光波長為405 nm,所對應的檢測器為PMT1,用于檢測DAPI發出的熒光,偽彩為藍色；第2通道激發光波長為488 nm,所對應的檢測器為PMT2,用于檢測GFP發出的熒光,偽彩為綠色；第3通道激發光波長為561 nm,所對應的檢測器為PMT2,用于檢測Aleax Flour 594發出的熒光,偽彩為紅色。

(2) 圖像獲取和處理。將培養皿置于激光共聚焦顯微鏡(leica SP8)載物臺的適配器內,在63×物鏡下選取感染了分枝桿菌的巨噬細胞。設置分辨率、掃描速度、針孔大小等掃描參數,調節控制面板上的PMT、offset等旋鈕,獲取熒光強度適合、背景較低的圖像。采用序列掃描的方式依次采集3個通道DAPI、GFP和Aleax Flour 594的熒光圖像,參考焦平面位置選取Z軸掃描范圍共6 μm,分3層進行拍攝,每層2 μm。使用徠卡共聚焦軟件LAS AF來獲取圖像,對圖像進行多層投射(maximum intensity projection)后保存圖像。對所拍攝的多層圖像利用3D軟件進行三維重建,分析亞細胞結構的空間關系。

3 實驗結果與討論

3.1 分枝桿菌與巨噬細胞溶酶體融合

使用共聚焦顯微鏡在DAPI熒光通道下觀察到巨噬細胞核呈現為藍色熒光(見圖1a),在GFP熒光通道下觀察到海分枝桿菌為明亮的綠色熒光(見圖1b),細長略彎曲,端鈍圓,呈短棒狀,大小約1～4×0.4 μm,呈單個或分枝狀排列,在Aleax Flour 594熒光通道下觀察到巨噬細胞內溶酶體lamp1蛋白被標記為紅色熒光(見圖1c)。在所采集的熒光圖像里可觀察到分枝桿菌和巨噬細胞內溶酶體融合的現象,其中分支桿菌(綠色熒光)與溶酶體lamp1蛋白(紅色熒光)共定位的部分呈現為黃色熒光。分枝桿菌未與巨噬細胞溶酶體融合的仍然呈現為明亮的綠色熒光(圖1d)。圖2為經LAS AF軟件3D重建后得到的細胞和細菌的三維立體圖像,可更形象、更直觀地觀察到分枝桿菌在巨噬細胞內的空間結構關系。

圖1 分枝桿菌與巨噬細胞溶酶體融合

圖2 分枝桿菌在巨噬細胞內的空間結構(3D)

3.2 激光共聚焦顯微鏡操作注意事項

溫度和濕度的變化對光學系統影響非常大,因此激光共聚焦顯微鏡需有專門的實驗室安放,做到干凈、防潮、防震。溫度恒定在22 ℃士1 ℃,濕度控制在20%～60%,如配有HyD檢測器溫度不能超過25 ℃、濕度不能超過60%。注意保護激光器。激光器在掃描前需預熱半小時,掃描結束關閉激光開關鑰匙后,一定要等風扇停止運轉再關閉“Laser Power” 按鈕[9]。

用于掃描的組織切片的厚度應在4～35 μm范圍內,如果太厚激發光會消耗在標本下部,組織切片的上部不能被充分激發。所使用蓋玻片的厚度應控制在0.13～0.17 mm以內,如蓋玻片太厚會吸收較多激發光,導致激發光不能在標本上聚焦[10]。

對于采用2種或以上熒光染料標記的樣品,可選擇序列掃描的方式，從而避免染料交叉激發和串色對掃描結果的影響。為了得到高質量的斷層掃描圖像,在保證熒光亮度的前提下,針孔光欄應開得盡量小,控制光學切片厚度,排除非焦平面雜散光的影響。但如果樣品的熒光非常弱,可通過增大針孔光欄的直徑來增加信號強度,但與此同時所獲取圖像的分辨率下降了。為了保持所拍攝樣品的活性,應使用較小的激發光強度,限制掃描時間,使用較低的激發光輸出功率和較高的PMT 電壓值,從而減少光漂白和光毒性。

對于一些較厚的腦組織切片或其他樣品,可通過Z軸方向的微量步進馬達對同一樣品不同層面掃描成像,并利用Lasaf軟件的3D重建功能得到細胞或組織的三維結構圖,更形象、更直觀地對樣品進行形態學觀察,從而體現共聚焦技術在形態及功能分析上的優勢[11-12]。

4 結束語

本教學實驗技術涵蓋了激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術、GFP表達質粒轉化海分枝桿菌、分枝桿菌感染巨噬細胞、免疫熒光標記技術等內容,可以使學生學習多種綜合實驗技能,培養了學生的實踐能力和科研創新意識。通過大型儀器綜合運用,使學生意識到僅僅理解大型儀器的理論知識是不夠的,儀器分析實驗不僅需要預先對樣品進行處理,而且需要對所采集圖像和數據進行再分析才能得到預期的測試結果。該綜合實驗將實驗教學與科研設計相結合,提高研究生科研過程中分析問題和解決問題的能力,為研究生在今后的科研工作中更好地使用此技術奠定了扎實的基礎。該教學實驗設計不僅使學生對于激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術有了更深入的理解,而且對于日后設計和開展其他兼具創新性和實用性的大型儀器實驗教學課程具有重要的指導意義。

References)

[1] Paddock S W, Eliceiri K W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques [M].New York:Methods Mol Biol,2014.

[2] 孫瑋,潘峰,王麗婷,等.醫學研究生“激光掃描共聚焦顯微技術”課教學方法研究[J].中國醫學裝備,2010,7(12):40-42.

[3] 楊怡姝,王小利,沈思嗣,等.激光掃描共聚焦顯微鏡原位檢測核酸及蛋白質的實驗教學設計[J].實驗技術與管理,2011,28(2):58-60.

[4] 曲靜,朱民田.激光掃描共聚焦顯微鏡實驗教學的探索[J].遼寧中醫藥大學學報,2011,3(3):220.

[5] Singh B, Ghosh J, Islam N M, et al. Growth, cell division and sporulation in mycobacteria[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,2010, 98(2):165-177.

[6] Vergne I, Chua J, Singh S B, et al. Cell biology of mycobacterium tuberculosis phagosome[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2004 (20), 367-394.

[7] Dong D, Wang D, Li M, et al.PPE38 modulates the innate immune response and is required for Mycobacterium marinum virulence[J].Infect Immun,2012, 80(1):43-54.

[8] Collins C A, De Maziere A, van Dijk S, et al. Atg5-independent sequestration of ubiquitinated mycobacteria[J]. PloS pathog,2009, 5(5):e1000430.

[9] 王煒.激光共聚焦顯微鏡的使用和管理[J].科技資訊,2011(21):116.

[10] 王麗婷,孫瑋,王麗馨,等.淺談激光掃描共聚焦顯微鏡的使用維護及保養[J].現代醫藥衛生,2012,28(20):3132-3133.

[11] Antunes A P, Covington A D, Petford N, et al. Three-dimensional visualization of dermal skin structure using confocal laser scanning microscopy[J]. J Microsc, 2013, 251(1):14-18.

[12] 薛秀花,張曉嫣,鄭東,等.激光共聚焦顯微成像技術在植物細胞微絲骨架三維動態觀察中的應用[J].現代儀器,2010,16(5):50-54.

Experimental teaching design on detection of fusion of mycobacterium and lysosome in macrophages by laser scanning confocal microscope

Qiao Ke, Wang Qinglan, Niu Chen

(Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Department of Pathogen Biology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China)

The experiment is designed in which macrophages were firstly infected by mycobacteria labelled with GFP marker, followed by detection of the fusion of mycobacteria and lysosomes in macrophages by laser scanning confocal microscope. This experiment is of great importance to the study of the interaction between mycobacteria and macrophages and the pathogenic mechanism of mycobacteria. Through this teaching experiment, students can get a deeper understanding on the laser scanning confocal microscope. Meanwhile, it can also cultivate the practical ability and innovation consciousness of the students in scientific research.

laser scanning confocal microscope; green fluorescent protein; mycobacterium; macrophage

2015- 04- 20 修改日期：2015- 05- 27

國家自然科學基金青年項目(81201256)

喬可(1981—),女,陜西西安,碩士,實驗師,主要從事病原生物學細胞和分子的影像學研究.

E-mail：qiaoke@fudan.edu.cn

G642.0

A

1002-4956(2015)12- 0187- 03