共表達NEP1-40和PRP-1多順反子重組scAAV的構建*

西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科 (西安 710061)

楊興春 白轉麗 王 瑞 柏宏亮▲

共表達NEP1-40和PRP-1多順反子重組scAAV的構建*

西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科 (西安 710061)

楊興春 白轉麗 王 瑞 柏宏亮▲

目的：構建共表達NEP1-40和PRP-1多順反子重組雙鏈腺相關病毒(scAAV)。方法：PCR擴增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。兩端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA，克隆到PES載體構建出重組質粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。雙酶切重組質粒PBV220-NT4-NAP和 PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，連接得到重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相關病毒pSS-CMV構建雙鏈腺相關病毒穿梭質粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。經(jīng)細胞內(nèi)同源重組得到共表達NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。測定病毒滴度并利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)檢測其生物活性。結果：克隆了共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子融合基因cDNA，基因測序及核苷酸序列同源性比較結果與設計序列一致；構建了重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，酶切鑒定、核酸序列測定結果與理論值一致；重組的雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1應用于雞胚背根神經(jīng)節(jié)顯示明顯促進神經(jīng)突起生長。 結論：成功構建了共表達NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，并顯示出促進雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用。

近年來脊髓損傷的病理生理研究中取得了可喜的進展，人們對脊髓損傷后的病理變化和再生困難的認識也有了更深的理解，概括說是多種因素相互作用的結果，其中既有抑制神經(jīng)突起的因素，也有促進神經(jīng)再生缺乏的原因，是否能將多種影響脊髓功能恢復的因素結合在一起進行研究？在分析當前研究進展的基礎上，本研究提出使用口蹄疫病毒的2A裂解點(FMDV 2A)構建多順反子表達載體，通過自互補型腺相關病毒(Self-complementary AAV, scAAV)載體，同時表達富含脯氨酸的下丘腦-垂體神經(jīng)保護肽(proline-rich peptide PRP-1)和中樞神經(jīng)元軸突生長抑制蛋白質Nogo的受體拮抗劑(NEP1-40)，試圖通過促進脊髓神經(jīng)再生和阻抑神經(jīng)突起再生蛋白受體(NgR)的雙向作用，為脊髓損傷臨床治療尋找可行的方法。

材料與方法

1 質粒與試劑 重組質粒PBV220-NT4-NAP質粒由楊宇博士惠贈，限制性內(nèi)切酶NaeⅠ、EcoRⅠ、Bam HI、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶等購自華美生物工程公司。人胚腎293細胞系、大腸桿菌E.Coli DH5α及載體質粒PES、pBV220-NT4 質粒、輔助質粒pAAV-Ad，腺相關病毒穿梭質粒pSSHG-CMV均由西安華廣生物工程公司提供。引物合成及測序由上海生物公司完成。

2 方 法

2.1 共表達NEP1-40和PRP-1與多順反子FMDV 2A融合基因cDNA克隆及序列分析

2.1.1 神經(jīng)肽PRP-1的cDNA克隆:由GenBank獲得PRP-1的氨基酸序列，在其氨基端加裝SRR前蛋白轉變酶識別序列AGC CGG CGT，創(chuàng)建Nae I的內(nèi)切酶識別位點。然后按照哺乳動物適宜密碼子原則合成cDNA，在cDNA的3`-端加TGA終止密碼子適宜的酶切點(圖1)。將合成的cDNA克隆到PES載體，測序正確后用Nae I和BamHI雙酶切回收PRP-1的cDNA。

圖1 合成的PRP-1 cDNA結構

2.1.2 神經(jīng)肽NEP1-40的cDNA克隆：從GenBank獲得大鼠Nogo-66 cDNA序列，設計正反向引物，在正向引物的5`-端加入編碼SRR的AGC CGG CGT酶識別點，同時也是前蛋白轉變酶識別點序列，RT-PCR擴增得到編碼SRR的NEP1-40 cDNA。然后將其克隆到PES載體，測序正確后用Nae I和BamHI雙酶切回收NEP1-40的cDNA。

2.1.3 等分子數(shù)共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A的cDNA克隆：從數(shù)據(jù)庫獲得了FMDV 2A的氨基酸序列，按照哺乳動物適宜密碼子原則合成編碼FMDV2A的cDNA。再重新合成NEP1-40的反向引物，新引物刪除TGA終止子和BamHI酶識別位點，使用正反引物并以建立的NEP1-40質粒為模板，擴增得到刪除了終止子的NEP1-40的cDNA。再根據(jù)FMDV2A的cDNA和刪除了終止子的NEP1-40的cDNA序列，合成Overlap PCR引物，使用Overlap PCR原理，擴增得到NEP1-40-FMDV 2A嵌合cDNA。再將已經(jīng)建立的PRP-1 cDNA用相同的方法嵌合到NEP1-40-FMDV 2A的下游，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA結構(圖2)。然后將其克隆到PES載體，測序正確后用Nae I和BamHI 雙酶切回收嵌合肽cDNA。

圖2 NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA結構示意圖

2.1.4 融合基因cDNA克隆：在嵌合肽NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的cDNA結構的兩端分別加入Flag標簽肽和6×His肽的cDNA序列后得到融合基因cDNA。將其克隆到PES載體，構建出含有融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重組質粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(圖3)，測序正確后用NaeI和BamHI雙酶切回收融合基因cDNA,交公司測序。

圖3 重組質粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1圖譜

2.2 融合基因表達盒的構建策略：重組質粒PBV220-NT4-NAP經(jīng)限制性內(nèi)切酶NaeⅠ與BamHⅠ聯(lián)合消化后，棄掉NAP，用1%瓊脂糖凝膠電泳法回收PBV220-NT4基因片段。同樣方法經(jīng)NaeⅠ與BamHI聯(lián)合消化PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，回收融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1片段。T4DNA連接酶連接兩片段，得到融合基因表達盒重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(圖4)。

圖4 融合基因表達盒重組質粒 pBV220-NT4 /NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1構建圖

2.3 重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的酶切鑒定及核酸序列測定：按照參考文獻[1]方法進行測定。

2.4 構建單鏈腺相關病毒穿梭質粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：堿裂解法大量制備已構建重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，用EcoRⅠ和BamHI酶切腺相關病毒pSS-CMV和pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，T4 DNA連接酶連接后轉化感受態(tài)細菌E.Coli DH5α菌株，提取質粒，酶切篩選并鑒定陽性克隆，用EcoRⅠ和BamHI酶切鑒定，篩選的單鏈AAV重組子命名為pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。

2.5 構建雙鏈腺相關病毒穿梭質粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：T4連接酶分別連接NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 cDNA 、線性化的scAAV 載體和△ITR-polyA3個片段，獲得分泌表達NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重組質粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，提取質粒，酶切篩選并鑒定陽性克隆，用EcoRⅠ和BamHI雙酶切鑒定。

2.6 重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的包裝及滴度測定：重組質粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1、輔助質粒pAAV-Ad、腺病毒全基因組質粒pFG140三質粒磷酸鈣共沉淀法轉染293細胞，篩選陽性轉化細胞，收獲并純化重組病毒，收獲的毒種感染293細胞，離心取上清，-20℃保存，濃縮的病毒使用Dig-GFP 探針斑點雜交法測定滴度。對重組病毒DNA進行PCR擴增、電泳測試。

2.7 生物活性測定：顯微解剖鏡下分離、摘取8d 雞胚背根神經(jīng)節(jié)(SC-DRG)，將其分散接種于涂布了多聚賴氨酸的平皿內(nèi)，加入培養(yǎng)基，浸沒神經(jīng)節(jié)。CO2孵箱內(nèi)，37℃封閉培養(yǎng)12 h 后，分別加入回收的融合基因表達蛋白0.1μl(實驗組)和等量的培養(yǎng)液(對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，相差倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)節(jié)生長情況。

結 果

1 共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因測序及核苷酸序列同源性比較：對合成的共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因序列進行測定。測序結果與設計序列完全一致。融合基因核苷酸克隆序列與設計的基因核苷酸序列一致。

2 共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因表達盒的鑒定

2.1 共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因表達盒的酶切鑒定：重組質粒 pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1經(jīng)NaeⅠ與BamHⅠ聯(lián)合消化后，1%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生3.852kb和0.48kb兩個片段，與理論值完全一致(圖5)。

A:未經(jīng)酶切的重組質粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1;B:經(jīng)NaeⅠ與BamHI雙酶切后的片段;C:DNA 標尺(單位bp)

圖5 融合基因表達盒重組質粒

pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1電泳圖

2.2 共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因表達盒的核酸序列測定：對電泳回收的重組融合質粒pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1插入片段進行核酸序列測定，與設計的序列完全一致，說明插入片段為融合基因。

3 單/雙鏈腺相關病毒穿梭質粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1鑒定：兩個腺相關病毒穿梭質粒酶切后均獲得了與預期相符480bp條帶。

4 重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的鑒定與滴度測定：對重組病毒DNA進行PCR擴增、電泳測定，產(chǎn)生3.852kb和0.48kb兩個片段，與理論值完全一致(圖6)。Dig-GFP 探針斑點雜交法測定滴度3.2×1010pfu/ml，表明構建的重組雙鏈腺相關病毒具有高滴度活性和病毒感染效應。

5 生物活性鑒定：實驗組中雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織周緣有神經(jīng)突起呈放射狀長出(圖7A)。對照組未見神經(jīng)突起長出(圖7B)。證實融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核細胞中得到了正確表達和翻譯后加工，具有促進雞胚背根神經(jīng)節(jié)軸突生長能力。

A:DNA 標尺(單位bp);B:經(jīng)NaeⅠ與BamHⅠ雙酶切后的片段;C:未經(jīng)酶切的重組質粒pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1

圖6 pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1質粒鑒定電泳圖

A :雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織培養(yǎng)法檢查原核表達的生物學活性，加入表達產(chǎn)物24h后，雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織周緣有大量神經(jīng)突起呈放射狀長處(×20，倒置相差顯微鏡);B:對照組未見神經(jīng)突起長出(×20，倒置相差顯微鏡)

圖7 生物活性鑒定圖

討 論

脊髓損傷后功能恢復的研究一直是醫(yī)學研究的熱點。眾多研究表明，目前所使用的方法還需要進一步的改進和加強，才有可能實現(xiàn)脊髓損傷后的機能重建。在分析當前研究進展的基礎上，本研究提出使用豬口蹄疫病毒2A裂解子(FMDV 2A)構建多順反子的自互補型腺相關病毒(scAAV)，目的是同時等分子數(shù)地表達脊髓神經(jīng)的突出再生促進肽(PRP-1)和阻斷內(nèi)源突出再生抑制蛋白的生物活性肽(NEP1-40)，通過雙作用機制來實現(xiàn)損傷脊髓的組織和機能重建。

Nogo是來自神經(jīng)鞘的突出生長抑制因子[2]，對神經(jīng)細胞突出再生具有的明顯抑制。NEP1-40是Nogo受體(NgR)的競爭性拮抗劑。脊髓損傷后寡突膠質細胞表面脫落的Nogo作用于NR來發(fā)揮作用。敲除NR的動物和使用抗NR抗體可以解除神經(jīng)突出的生長抑制，脊髓和外周神經(jīng)損傷后的突出再生可以大大加強[2]。Hanell A等報告NEP1-40能夠和NR結合，竟爭性抑制Nogo-66的突出再生抑制作用[3]。研究者[4,5]局部使用合成的NEP1-40治療大鼠中段脊髓背側半切，幾天后見到明顯的突出再生和機能恢復。

富含脯氨酸多肽(PRP)是一組富含脯氨酸的具有神經(jīng)保護功能的短肽類細胞因子[6]。Galoyan每日給坐骨神經(jīng)橫斷和脊髓橫斷的大鼠肌肉注射10μg/100g的PRP-1，3周后有組織學的恢復和機能改善[7]，而且PRP-1能夠治療鈍挫傷引起的脊髓和腦神經(jīng)變性。提示PRP-1在損傷和退行性腦及脊髓損傷的治療中有巨大潛在應用價值。

FMDA 2A裂解因子是口蹄疫病毒( FMDV)的多聚前體蛋白在2A 的羧基端存在的一小段自裂解序列[8]，其多肽序列中含有一個高度保守的基序，并在2A起始剪切中起到關鍵作用。FMDV 2A的剪切活力達100%，且FMDV 2A基因的選擇與上下游順序對其剪切活性基本沒有影響。使用FMDV 2A可以方便的構建多順反自子表達載體，能同時表達兩種以上的目的蛋白或目的肽。本研究選用FMDV 2A裂解子構建多順反子表達載體，目的使獲得上下游神經(jīng)保護肽NEP1-40和PRPs都能得到有效的表達[9]。這種同時表達多種神經(jīng)再生和營養(yǎng)因子的雙靶向雙基因治療策略(Dual-Targeting Dual Gene-Virotherapy)，有利于在脊髓損傷的基因治療中產(chǎn)生更好的效果。

自互補型腺相關病毒(scAAV)是近年來重組AAV的重要改進[10]。scAAV進入細胞后可以直接表達，不需要由單鏈變?yōu)殡p鏈的過程，而且表達水平相對較高，非常適于在要求目的基因快速表達且需要較高表達水平的基因治療方案中[11]。scAAV的缺點是包裝容量的進一步減低，通常不能超越2.1kb[12]。本研究目的cDNA片段短小，構建的表達盒能夠滿足scAAV的包裝要求。

本實驗成功克隆了共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合基因cDNA，經(jīng)對其進行基因測序及核苷酸序列同源性比較，顯示克隆序列與設計序列完全一致。將共表達NEP1-40和PRP-1的多順反子FMDV 2A融合全基因與NT4的信號肽連接，構建了融合基因表達盒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，經(jīng)酶切鑒定、核酸序列測定和編碼區(qū)編碼氨基酸序列推導，結果顯示與理論值完全一致。通過腺相關病毒pSS-CMV先后構建單/雙鏈腺相關病毒穿梭質粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，電泳酶切產(chǎn)物顯示與預期大小一致的片段。通過共轉染技術、經(jīng)細胞內(nèi)同源重組、包裝后得到共表達NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。測定重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1病毒滴度也顯示具有高滴度活性和病毒感染效應。將其應用于體外培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，表達蛋白組中有大量神經(jīng)突起向組織塊外四周呈放射狀長出，而單純培養(yǎng)液組未見明顯神經(jīng)突起長出。表明構建的共表達NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核細胞中得到了正確表達和翻譯后加工，產(chǎn)生并分泌了具有生物學活性蛋白，這將為今后進行的動物實驗奠定了基礎，并為脊髓損傷的基因治療提供了新的思路。

[1] 薩姆布魯克,拉塞爾(美)著,黃培堂 主譯. 分子克隆實驗指南[M].北京: 化學工業(yè)出版社,2007: 405-436.

[2] Gonzenbach RR, Gasser P, Zorner B,etal. Nogo-A antibodies and training reduce muscle spasms in spinal cord-injured rats. Ann Neurol,2010,68(1):48-57.

[3] Hanell A, Clausen F, Bjork M,etal. Genetic deletion and pharmacological inhibition of Nogo-66 receptor impairs cognitive outcome after traumatic brain injury in mice[J]. J Neurotrauma,2010,27(7):1297-1309.

[4] Suehiro K, Nakamura Y, Xu S,etal. Ecto-domain phosphorylation promotes functional recovery from spinal cord injury[J]. Sci Rep,2014,15(4):4972-4981.

[5] Zhilai Z, Hui Z, Yinhai C,etal. Combination of NEP 1-40 infusion and bone marrow-derived neurospheres transplantation inhibit glial scar formation and promote functional recovery after rat spinal cord injury[J].Neurol India,2011,59(4):579-585.

[6] Galoyan AA, Krieglstein J, Klumpp S,etal. Effect of hypothalamic proline-rich peptide (PRP-1) on neuronal and bone marrow cell apoptosis[J]. Neurochem Res,2007,32(11):1898-1905.

[7] Armen A, Galoyan D, John S,etal. Neuroprotective action of hypothalamic peptide PRP-1 at various time survivals following spinal cord hemisection[J]. Neurochemical Research, 2005,30:507-525.

[8] Goodwin S, Tuthill TJ, Arias A,etal. Foot-and-mouth disease virus assembly: processing of recombinant capsid precursor by exogenous protease induces self-assembly of pentamers in vitro in a myristoylation-dependent manner[J]. J Virol,2009,83(21):11275-11282.

[9] Cao Y, Sun P, Fu Y,etal. Formation of virus-like particles from O-type foot-and-mouth disease virus in insect cells using codon-optimized synthetic genes[J].Biotechnol Lett,2010,32(9):1223-1229.

[10] Hollis Ii ER, Kadoya K, Hirsch M,etal. Efficient retrograde neuronal transduction utilizing self-complementary AAV[J].Mol Ther,2008,16(2):296-301.

[11] 王俊紅,王 楓,董 鵬,等. 雙鏈腺相關病毒介導表達Exendin-4治療糖尿病大鼠的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報,2013,35(17): 1831-1835.

[12] Wu Z, Sun J, Zhang T,etal. Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directed expression results in sustained correction of hemophilia B at low vector dose[J]. Mol Ther, 2008,16(2):280-289.

(收稿：2014-12-15)

Construction of Multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage actor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1 Burn & Plastic Department of the First Affiliated Hospital of Medical School of

Xi’an Jiaotong University (Xi’an 700061)

Yang Xingchun Bai Zhuanli Wang Rui et al

Objective: To construct the multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage factor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1. Methods: PCR technology was used to amplify the NEP1-40, PRP-1 and FMDV2A cDNA. The chimeric peptide cDNA containing NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was set up. Then the fusion gene cDNA was synthetized after adding the Flag peptides and 6×His peptides at ends. The recombinant plasmid PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed by cloning the fusion gene into the PES vector. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained after digesting and connecting the plasmid PBV220-NT4-NAP and PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1. The double-stranded AAV shuttle plasmid ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed basing on the AAV pSS-CMV. Finally the recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained by homologous recombination in cells. The titer of the recombinant scAAV was measured and its biological activity was detected in the chicken embryo dorsal root ganglion (EDRG). Results: The fusion gene cDNA for co-expressing NEP1-40 and PRP-1 was cloned. The gene sequencing and nucleotide sequence homology comparison show consistent with the design sequence. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed and the results of enzyme identification and the nucleic acid sequence were consistent with the theoretical value. The growth of neural processes showed obviously after using the recombinant scAAV in chicken EDRG. Conclusion: The recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 is constructed successfully and displays promoting role in the chicken EDRG.

@Proline-rich peptide PRP-1 @NEP1-40 Foot and mouth disease virus @Multicistronic vector @Self-complementary AAV

*陜西省科技研究發(fā)展(攻關)計劃項目(2011K12-12)

@富含脯氨酸多肽 @NEP1-40 口蹄疫病毒 @多順反子載體 @自互補型腺相關病毒

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.002

▲通訊作者