蔗梢多酚類化合物抗氧化與抗腫瘤活性研究

何雪梅,孫 健,,*,李 麗,盛金鳳,趙謀明

(1.廣西農業科學院農產品加工研究所,廣西南寧 530007;2.廣西作物遺傳改良生物技術重點實驗室,廣西南寧 530007;3.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

蔗梢多酚類化合物抗氧化與抗腫瘤活性研究

何雪梅1,2,孫 健1,2,3,*,李 麗1,2,盛金鳳1,2,趙謀明3

(1.廣西農業科學院農產品加工研究所,廣西南寧 530007;2.廣西作物遺傳改良生物技術重點實驗室,廣西南寧 530007;3.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

研究從蔗梢中分離到的8種多酚類化合物的抗氧化活性和抗腫瘤活性。采用DPPH自由基清除能力、氧自由基吸收能力(ORAC)和ABTS自由基清除能力綜合評價多酚化合物的體外抗氧化活性,MTT法評價多酚化合物的體外抗腫瘤活性。實驗表明,8種化合物中槲皮素的DPPH自由基清除能力顯著(p<0.05)高于陽性對照Trolox;咖啡酸抑制CNE2(人鼻咽癌細胞)增殖的活性最強,槲皮素抑制SGC7901(人胃癌細胞株)增殖的活性最強,2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃和槲皮素能較強地抑制Hela(人宮頸癌細胞株)的增殖。蔗梢中的8種多酚類化合物均具有較強的抗氧化活性和一定的抗腫瘤活性,可作為保健食品和保健品的開發原料。

蔗梢,多酚類化合物,抗氧化活性,抗腫瘤活性

甘蔗是禾本科(Graminaeeae)甘蔗屬(SaccharumL.)植物,是我國制糖的主要原料。我國是世界三大甘蔗起源中心之一,目前已成為居巴西、印度之后的世界第三大食糖生產國,其中廣西為我國甘蔗第一大省,約占全國總面積的60%[1]。蔗梢,又稱甘蔗尾葉,是收獲甘蔗時頂上最嫩節和青綠葉片的統稱,約占甘蔗生物量的10%,是甘蔗生產中的主要副產物之一。廣西每年有幾千萬噸的蔗梢廢棄物,除少部分作飼料和留種以外,大部分被焚燒,既造成嚴重的空氣污染與安全隱患,又浪費資源,開發利用迫在眉睫。

目前甘蔗的精深加工利用多集中在蔗莖、蔗渣和糖蜜等方面,國際上特別是巴西、日本和臺灣對甘蔗汁、甘蔗葉以及蔗糖加工中的中間產物和副產物中多酚物質的深入研究較多,發現這幾類物質中多酚化合物以酚酸、黃酮和黃酮苷為主,具有抗氧化、抗腫瘤和治療胃潰瘍等功效[2-4]。國內外對蔗梢的研究利用較少,多停留在蔗梢青貯飼料、食用蔗筍、蔗梢汁飲料等初加工方面[5-7]。蔗梢富含多酚,據報道蔗梢雖然只占蔗莖的小部分,但多酚類物質含量比蔗莖還多,且比較集中[8]。目前蔗梢多酚的研究還停留在多酚的提取工藝及含量測定層面,對甘蔗多酚的深入系統研究未見報道。為探明蔗梢多酚的化學組成,前期開展了蔗梢多酚類化合物的分離純化、結構鑒定,從蔗梢中分離到8種多酚類化合物,并鑒定了其化學結構,此部分工作已另文發表[9]。本文對這8種多酚類化合物的抗氧化和抗腫瘤活性進行研究,以期為蔗梢多酚的開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8種蔗梢多酚類化合物由本實驗室分離鑒定[9],分別為4-羥基肉桂酸、芹菜素、咖啡酸、槲皮素、3-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮、5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮、8-(2,4-二羥苯基)-5-羥基-2-甲基-2-(4-甲基戊-3-烯基)-吡喃并苯并吡喃-6-酮、2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃。

Trolox、AAPH、DPPH、熒光素鈉、MTT (四甲基噻唑藍) 美國sigma公司;順鉑 昆明貴研藥業有限公司;細胞:CNE2 (人鼻咽癌低分化鱗狀上皮細胞,人鼻咽癌細胞株);SGC7901(人胃癌細胞株),Hela(人宮頸癌細胞株) 由暨南大學醫學院提供;所用試劑均為分析純。

752N紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠;101-3電熱鼓風恒溫干燥箱 上海浦東形容科學儀器有限公司;CU600型電熱恒溫水箱 上海福瑪實驗有限公司;CO2培養箱 美國Thermo Forma公司;NP-S-15-500超聲波生化儀 廣東新動力超聲電子有限公司;Elx800全自動酶標儀 奧地利DIALAB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蔗梢多酚類化合物抗氧化活性的測定

1.2.1.1 DPPH自由基清除能力測定 用無水乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液,樣品組分別加入2 mL樣品和2 mL DPPH自由基溶液,對照組加入2 mL 50%乙醇和2 mL DPPH自由基溶液,用渦旋振蕩器充分混勻,避光反應30 min后在517 nm處測定吸光度值[10]。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A對照]×100

式(1)

1.2.1.2 氧自由基吸收能力(ORAC)評價 ORAC評價方法參考Joseph等[11]的方法并加以改進。用75 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.4)配制濃度為39.9 μmol/L的熒光素鈉儲備液,于4 ℃避光保藏。用75 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.4)稀釋熒光素鈉儲備液,即得濃度為0.159 μmol/L的熒光素鈉使用液。AAPH用75 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.4)配制濃度為38.25 mmol/L溶液,每次使用的AAPH均為新鮮配制,使用前置于冰水中。精確稱取Trolox,用無水乙醇配成2 mmol/L溶液,并用75 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.4)稀釋成不同濃度。

預先將酶標儀預溫至37 ℃,保持反應體系溫度恒定為37 ℃。設定激發波長為485 nm,發射波長為530 nm。在96孔板中,每孔加入25 μL樣品溶液或Trolox溶液,空白對照為緩沖溶液,然后加入75 μL熒光素鈉使用液,將板放入酶標儀中,37 ℃孵育10 min。加100 μL AAPH后,開始計時反應并讀數(f0),每分鐘讀一次數(f1,f2,…,f70),共讀71次(共計時反應70 min),將每次讀數連成曲線。每個樣品設置3個重復孔,AUC表示曲線下的面積。

AUC=0.5(f0+fn)+(f1+f2+…+fi+…+fn-1)

式(2)

Net AUC=AUCsample-AUCblank

式(3)

Trolox濃度與其Net AUC成正比,將樣品Net AUC代入,換算得到ORAC值,即樣品相當于Trolox的量(μmol Trolox 當量/μmol)。

1.2.1.3 ABTS自由基清除能力測定 實驗參考Cao[12]、Smith[13]的方法并加以改進,將ABTS溶解在2.45 mmol/L K2S2O8水溶液中,配成7 mmol/L的溶液,避光放置12～16 h,得到ABTS+·儲備溶液。用磷酸鈉緩沖液(10 mmol/L)將ABTS+·儲備溶液稀釋至吸光度值為0.70±0.02(734 nm),即得ABTS+·工作液。取100 μL樣品溶液于10 mL試管中,加入4 mL ABTS+·工作液,漩渦震蕩30 s,于734 nm測吸光度值。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A對照]×100

式(4)

1.2.2 蔗梢多酚類化合物體外抗腫瘤活性 CNE2、SGC7901、Hela接種在含10%胎牛血清的DMEM培養基中,于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,接種于96孔細胞培養板上(3×104cells/mL),每孔100 μL。置37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后,實驗組分別加入樣品,對照組則加入等體積溶劑,每組3孔,重復3次。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養3 d,加入MTT(5 mg/mL)20 μL繼續培養4 h,棄上清,加入DMSO 150 μL,震蕩15 min,以酶標儀在490 nm處測各孔吸光度值,按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率[14-15],利用對數幾率圖解法計算樣品的半數抑制濃度(IC50)。

腫瘤細胞生長抑制率(%)=1-A490(實驗組)/A490(對照組)×100

式(5)

2 結果與討論

2.1 蔗梢多酚化合物的抗氧化活性

圖1 蔗梢中8中多酚化合物的化學結構Fig.1 Chemical structure of eight polyphenol compounds from sugarcane tops

8個多酚化合物的抗氧化實驗結果見表1。實驗中的8個化合物的結構鑒定過程已另文發表[9],化學結構見圖1,主要有酚酸類、黃酮類和苯并呋喃類三種,從結構上看,多酚類化合物是指分子結構中有若干個酚性羥基的植物成分的總稱,包括酚酸和黃酮類化合物。黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(A-與B-環)通過中央三碳原子相互連結而成的一系列化合物,其化學結構骨架為C6-C3-C6。苯并呋喃類的化學骨架為C6-C3。其中咖啡酸和4-羥基肉桂酸為酚酸類,槲皮素、芹菜素、8-(2,4-二羥苯基)-5-羥基-2-甲基-2-(4-甲基戊-3-烯基)-吡喃并苯并吡喃-6-酮、3-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮、5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮為黃酮類,2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃為苯并呋喃類。

從表1中可以看出,化合物抗氧化能力的大體趨勢為,黃酮類>酚酸類>苯并呋喃類,其中,槲皮素、咖啡酸和5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的DPPH自由基清除率顯著(p<0.05)高于陽性對照Trolox,芹菜素和8-(2,4-二羥苯基)-5-羥基-2-甲基-2-(4-甲基戊-3-烯基)-吡喃并苯并吡喃-6-酮與Trolox無顯著性差異(p>0.05),4-羥基肉桂酸、3-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮、2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃顯著低于Trolox(p<0.05);咖啡酸、槲皮素、芹菜素、3-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的ABTS自由基清除率與陽性對照Trolox無顯著性差異(p>0.05),其他化合物的ABTS自由基清除率顯著低于Trolox(p<0.05);5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的ORAC值顯著高于其他化合物(p<0.05)。多酚類化合物結構特點是苯基上連接有多個羥基,易失去羥基上的質子,其抗氧化能力依賴于失去H質子后,所形成苯氧自由基的穩定性,化合物中的共軛結構越大,其苯氧自由基越穩定[16-17]。因此,多酚類化合物抗氧化能力的高低與所含羥基的數量及鄰苯二酚結構的數量有關,這也解釋了本文中的實驗結果,黃酮類化合物所含的酚羥基較多,其次是酚酸類,最后是苯并呋喃類。在這8個蔗梢多酚類化合物中,槲皮素和咖啡酸含有鄰苯二酚結構,實驗結果證實,綜合來看這兩種化合物的抗氧化活性較其他化合物強。

表1 8個蔗梢多酚類化合物的抗氧化活性

注:同列兩組數據間標注字母不同者,表示兩組數據有顯著性差異(p<0.05),表2同。

表2 8個蔗梢多酚化合物單體的抗腫瘤活性

2.2 蔗梢多酚化合物的抗腫瘤活性

本實驗選擇了三種常見的腫瘤細胞考察蔗梢多酚化合物的抗腫瘤活性,具體結果見表2。實驗結果表明,幾種化合物對不同的腫瘤細胞表現出不同的抑制增殖能力。咖啡酸抑制CNE2(人鼻咽癌細胞株)增殖的活性顯著高于其他7種化合物,但顯著低于對照順鉑(p<0.05),而且在抑制其他兩種腫瘤細胞增殖時表現并不突出。槲皮素能有效地抑制SGC7901(人胃癌細胞株)的增殖,抑制活性與順鉑無顯著性差異(p>0.05);2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃和槲皮素能有較強地抑制Hela(人宮頸癌細胞株)的增殖,但抑制活性顯著低于順鉑(p<0.05)。綜合本文8種多酚化合物的抗腫瘤活性,發現槲皮素的綜合抗腫瘤活性最高。已有研究表明槲皮素能在毫摩爾濃度直接抑制皮膚腫瘤、白血病、結腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和結腸癌等多種腫瘤細胞的增殖[20]。銀合歡種子中槲皮素對人肝癌細胞株BEL7404、人胃癌細胞株SGC7901及人鼻咽癌細胞株CNE的增殖具有抑制作用[21]。槲皮素抗腫瘤作用的機理已有深入研究,槲皮素可特異性地誘導人HeLa細胞凋亡,其誘導凋亡的機制可能與caspase-3、caspase-8活化有關[22],通過誘導細胞周期停滯和細胞凋亡而抑制肝癌HepG2細胞增殖[23]。槲皮素能夠有效抑制胃癌SGC-7901的生長,呈時間劑量依賴性,抑制增生與誘導凋亡的機制可能與HSP70和EGFR表達的下調有關[24],王海燕等發現,槲皮素通過降低C-myc蛋白表達和促進P16蛋白表達,下調C-myc mRNA的表達的同時上調P16 mRNA的表達,來抑制胃癌MGC-803細胞的生長并誘導其發生凋亡,表現出抗腫瘤效應[25]。

多酚類化合物因結構中取代基不同,其抗腫瘤活性有很大差異,構效關系非常復雜,主要集中在羥基的位置和數量、雙鍵的位置上。以黃酮為例,分子中含有2～4個酚羥基、C環2,3為雙鍵、B環定位于2位、含有鄰苯二酚結構,是其關鍵的結構-效應元件,具有這些元件的黃酮其抗腫瘤活性較強,反之則無抗腫瘤活性[18-19]。本文的實驗結果與上述規律也有一定程度符合,槲皮素含有鄰苯二酚,且酚羥基數量為5個,C環2,3為雙鍵結構;咖啡酸和2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃也具有鄰苯二酚結構,酚羥基數量為3個。這也從結構上解釋了其抗腫瘤活性較強的原因。

3 結論

從蔗梢多酚提取物中分離到的8種多酚化合物具有較好的抗氧化活性和一定的抗腫瘤活性。槲皮素、咖啡酸和5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的DPPH自由基清除率顯著高于陽性對照Trolox(p<0.05),咖啡酸、槲皮素、芹菜素、3-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的ABTS自由基清除率與陽性對照Trolox無顯著性差異(p>0.05),5′-異戊烯基-5,7,2′,4′-四羥基黃酮的ORAC值顯著高于其他化合物(p<0.05)。咖啡酸抑制CNE2增殖的活性最強,槲皮素抑制SGC7901增殖的活性最強,2-(3,5-二羥苯基)-5-羥基-苯并呋喃和槲皮素能較強地抑制Hela的增殖,但它們抑制腫瘤細胞增殖的能力顯著低于陽性對照順鉑(p<0.05)。從化學結構上看,多酚類化合物抗氧化和抗腫瘤活性的高低與所含羥基的數量及鄰苯二酚結構的數量有關。

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Antioxidant and antitumor activities of polyphenol compounds from sugarcane top

HE Xue-mei1,2,SUN Jian1,2,3,*,LI Li1,2,SHENG Jin-feng1,2,ZHAO Mou-ming3

(1.Agro-food Science and Technology Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory,Nanning 530007,China;3.College of Light Industry and Food,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

The antioxidant and antitumor biological activities of eight polyphenol compounds which were separated from sugarcane top were studied. The test results showed that DPPH radical scavenging activity of quercetin was significantly higher (p<0.05)than that of positive control Trolox. Caffeic acid showed the strongest inhibiting activity on CNE2 proliferation. Quercetin exhibited the strongest inhibiting activity on SGC7901 proliferation. 2-(3,5-Dihydroxy phenyl)-5-hydroxy-benzofuran and quercetin possessed stronger inhibiting activity on Hela proliferation. Eight polyphenolic compounds of sugarcane top exhibited good antioxidant activities and antitumor activities,indicated that sugarcane top would be good material for health products and health foods.

sugarcane top;polyphenol compounds;antioxidant activities;antitumor activities

2015-05-13

何雪梅(1981-)，女，博士研究生，助理研究員，主要從事天然藥物化學研究，E-mail:xuemeihe1981@126.com。

*通訊作者:孫健(1978-)，男，博士，研究員，主要從事農產品貯藏加工研究，E-mail:jiansun@gxaas.net。

廣西農業科學院基本科研業務專項(桂農科2013YM03；桂農科2014YQ04)；公益性行業(農業)科研專項經費項目(201403064)；2014年中央財政農業技術推廣服務資金項目(桂財農函[2014]294號)；廣西科學研究與計劃開發計劃項目(桂科合14123001-10)；2011年度留學人員科技活動項目擇優資助經費(桂人社辦發[2012]250號) 。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0343-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.063