大豆玉米復(fù)合肽液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

朱志紅,徐艷陽(yáng),仇 洋,關(guān)歡歡,繆彬彬

(吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130022)

大豆玉米復(fù)合肽液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

朱志紅,徐艷陽(yáng)*,仇 洋,關(guān)歡歡,繆彬彬

(吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130022)

以豆粕和玉米蛋白粉為原料,應(yīng)用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制備大豆玉米復(fù)合肽。首先考察豆粕和玉米蛋白粉配比、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)復(fù)配蛋白的水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,并建立了相應(yīng)的回歸模型。結(jié)果表明,豆粕和玉米蛋白粉配比為2∶1時(shí),液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度為37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為184 r/min、發(fā)酵時(shí)間為51 h、接種量為4%。在此條件下發(fā)酵的蛋白水解度為25.73%±1.78%、肽轉(zhuǎn)化率為33.23%±1.06%,與理論預(yù)測(cè)值基本相符。該研究結(jié)果為豆粕和玉米蛋白粉的深加工及綜合利用提供科學(xué)參考。

豆粕,玉米蛋白粉,液態(tài)發(fā)酵,枯草芽孢桿菌,大豆玉米復(fù)合肽

生物活性肽是指分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的不同氨基酸組成片段,因其結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間而具有多種生物功效,近年來(lái)備受關(guān)注[1]。植物蛋白是制備生物活性肽的常用原料之一,豆粕和玉米蛋白粉分別是大豆提取油脂和玉米提取淀粉后的副產(chǎn)物,二者均含豐富的蛋白質(zhì),是優(yōu)良的植物蛋白資源。我國(guó)的豆粕和玉米蛋白粉多用于飼料工業(yè),利用率和附加值均較低[2-3]。國(guó)內(nèi)外的研究表明將植物蛋白制成生物活性肽,不僅提高其應(yīng)用價(jià)值,而且具有多種生物功效[4-5]。如張強(qiáng)[6]、王莉娟[7]、Zaelk shin[8]等研究表明大豆肽具有降血壓、抗氧化等功效;昌友權(quán)[9]、朱艷華[10]、Yamaguchi M[11]等研究表明玉米肽具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞、抗氧化、醒酒等功效。將大豆蛋白和玉米蛋白混合,通過(guò)發(fā)酵法或酶法水解得到的肽混合物即為大豆玉米復(fù)配肽。如王進(jìn)[12]應(yīng)用酶法水解豆粕和玉米黃粉獲得了的復(fù)合肽,結(jié)果表明不僅使蛋白增加附加值,氨基酸的構(gòu)成和蛋白質(zhì)的消化率得以改善,而且復(fù)合肽的降血壓功效比單一蛋白獲得的活性肽高。

生產(chǎn)活性肽的制備技術(shù)有酶法和微生物發(fā)酵法。目前,工業(yè)化酶法生產(chǎn)的活性肽主要是用商業(yè)化的蛋白酶,安全性好、品質(zhì)高,但是蛋白酶的種類少、成本高,限制了活性肽的生產(chǎn)和發(fā)展。微生物發(fā)酵法是將微生物酶和蛋白質(zhì)降解結(jié)合起來(lái)生產(chǎn)活性肽,既能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝又能降低生產(chǎn)成本,同時(shí)提高了蛋白資源的利用率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有較好的應(yīng)用前景[13]。其中,液態(tài)發(fā)酵法因具有生產(chǎn)周期短、占地面積小、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)條件穩(wěn)定,并且可以機(jī)械化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。目前對(duì)大豆和玉米復(fù)合蛋白的微生物發(fā)酵制備方面的研究較少,因此,本文應(yīng)用酶系較優(yōu)的枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕和玉米蛋白粉液態(tài)發(fā)酵制備大豆玉米復(fù)配肽的工藝進(jìn)行研究,旨在為豆粕和玉米蛋白粉的綜合利用和深加工提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillusnatto) 本院食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供;玉米蛋白粉(蛋白質(zhì)含量61.26%) 長(zhǎng)春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;豆粕(蛋白質(zhì)含量40.77%) 吉林華裕食品公司。

蛋白胨、葡萄糖 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酚酞、溴麝香草酚藍(lán)、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、乙醇、甲醛等 均為分析純,北京化工廠;桿菌肽(Mr 1422.69) 上海源葉生物科技有限公司。

F80型高速粉碎機(jī) 金城市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHP060型恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;LD4-2A型低速離心機(jī) 北京市雷勃爾離心機(jī)有限公司;DSX-280A型高壓蒸汽滅菌鍋 上海宜川儀器廠;BS-IE振蕩培養(yǎng)箱 國(guó)華電器有限公司;JJ200電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 種子菌懸液的制備

種子培養(yǎng)液配方:1.5 g葡萄糖、3.0 g蛋白胨、0.4 g磷酸氫二鉀、0.2 g磷酸二氫鉀、0.05 g硫酸鎂、45 mL去離子水,調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

用無(wú)菌接種環(huán)挑取枯草芽孢桿菌干粉于種子培養(yǎng)液中,在30 ℃、180 r/min恒溫振蕩箱中培養(yǎng)42 h,得初始菌懸液。再取3%(mL/mL)的初始菌懸液于種子培養(yǎng)液中,同樣條件下培養(yǎng),獲得酶活力1000～1200 U/mL的種子菌懸液,備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白水解度(DH)的測(cè)定 蛋白水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[14]。其計(jì)算公式如下:

式(1)

式(1)中,DH:蛋白水解度;V1:滴定蛋白水解液消耗氫氧化鈉的體積(mL);V2:滴定空白消耗氫氧化鈉的體積(mL);V3:蛋白水解液的體積(mL);M1、M2:豆粕、玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g);1.4008∶1mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液相當(dāng)?shù)牡?mg);6.25、6.24:豆粕、玉米蛋白粉中氮與蛋白質(zhì)的換算系數(shù)。

1.3.2 肽轉(zhuǎn)化率測(cè)定

1.3.2.1 桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線參考徐艷陽(yáng)[15],并加以修改。將桿菌肽溶于5%(g/mL)三氯乙酸(TCA)中,配成濃度為1.8mg/mL桿菌肽溶液,依次稀釋為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mg/mL桿菌肽溶液。分別吸取3mL不同濃度的桿菌肽溶液于相應(yīng)試管中,各加入2mL雙縮脲試劑,混勻,靜止顯色30min,在紫外分光光度540nm下測(cè)其吸光度。以桿菌肽的濃度為橫坐標(biāo),吸光度(OD值)為縱坐標(biāo),繪制桿菌肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 肽轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 用雙縮脲法測(cè)定肽轉(zhuǎn)化率。量取2mL發(fā)酵液,加入等體積10%(g/mL)TCA溶液,混勻、靜置10min后以3000r/min離心10min,取上清液1mL于各試管中,加2mL去離子水和2mL雙縮脲試劑,混勻,靜止顯色30min,相應(yīng)做空白實(shí)驗(yàn),在紫外分光光度540nm下測(cè)吸光度。肽轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式如下:

式(2)

式(2)中,A:大豆玉米復(fù)配肽的濃度,(mg/mL);M1、M2:豆粕、玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,(g);V3:蛋白水解液的體積(mL);N:樣液稀釋倍數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案

1.4.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)合蛋白工藝過(guò)程 準(zhǔn)確稱取玉米蛋白粉1.25 g和豆粕3.75 g,加100 mL去離子水,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH至8.0,于121 ℃蒸煮20 min,取出冷卻至室溫,即得5%(g/mL)的發(fā)酵原料。然后向發(fā)酵原料中加入3%(mL/mL)種子菌懸液,混勻,于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后,置沸水浴中加熱10 min滅酶,然后迅速冷卻至室溫,以4000 r/min離心20 min獲取上清液,測(cè)定上清液的蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 操作同1.4.1,采用控制變量法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分別為發(fā)酵時(shí)間:24、48、60、72、84 h;發(fā)酵溫度:31、34、37、40、43 ℃;搖床轉(zhuǎn)速:140、160、180、200、220 r/min;接種量:1%、2%、3%、4%、5%(mL/mL);豆粕與玉米蛋白粉的配比:1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間和接種量為自變量,蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值。采用Box-Benhnken中心組合進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼表

1.4.4 大豆肽、玉米肽、大豆玉米復(fù)合肽比較設(shè)計(jì) 取三個(gè)錐形瓶,分別裝入一定量豆粕粉、玉米蛋白粉、玉米蛋白粉和豆粕混合物,加一定量去離子水,得不同的液態(tài)發(fā)酵原料,參考操作1.4.1,在最優(yōu)發(fā)酵條件下分別獲取液態(tài)發(fā)酵大豆肽、玉米肽和大豆玉米復(fù)合肽的上清液,測(cè)定各上清液的蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率進(jìn)行比較、分析。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,采用Excel 2007計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及繪圖;采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD多重差異比較;采用Design-Expert 8.06 軟件進(jìn)行響應(yīng)面法(RSM)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

桿菌肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Bacitracin

通過(guò)最小二乘法獲得回歸方程為:y=0.0667x-0.0124,R2=0.9971。由回歸系數(shù)R2可知桿菌肽的濃度在0～1.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響 在其他液態(tài)發(fā)酵條件一致情況下,考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響,結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Influence of fermentation time on DH of protein and peptide conversion rate

由圖2可知,發(fā)酵時(shí)間在48 h時(shí),蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率均達(dá)較高。蛋白水解度在48 h之前,呈上升趨勢(shì),其原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),菌體產(chǎn)生蛋白酶增多,進(jìn)而水解更多蛋白。超過(guò)48 h之后,蛋白水解度呈下降趨勢(shì),其原因大致是發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分缺失或者復(fù)合蛋白成分減少,使菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶能力和酶作用力受到了抑制,超過(guò)72 h蛋白水解度再次增加,可能原因是液體發(fā)酵過(guò)程中,因含水量大,發(fā)酵時(shí)間影響發(fā)酵底物的pH變化,起初pH改變較小,隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),pH逐漸減小,進(jìn)而影響菌體對(duì)底物的水解[16]。經(jīng)方差分析可知,不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p<0.01,p<0.01)。其中,經(jīng)LSD多重差異比較分析,發(fā)酵時(shí)間48 h與36、60、72、84 h之間肽轉(zhuǎn)化率差異不顯著(p=0.574>0.05,p=0.862>0.05,p=0.065>0.05,p=0.062>0.05),且發(fā)酵時(shí)間為48 h用時(shí)較短。所以,綜合考慮發(fā)酵時(shí)間選取48 h較佳。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響 在其他液態(tài)發(fā)酵條件一致下,考察發(fā)酵溫度對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響,結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Influence of fermentation temperature on DH of protein and peptide conversion rate

由圖3可知,液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中,31～37 ℃時(shí),蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率與發(fā)酵溫度呈正相關(guān),37 ℃時(shí),其蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率最大,超過(guò)37 ℃后,蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率與發(fā)酵溫度呈負(fù)相關(guān),其原因是溫度較低時(shí),未達(dá)到菌生長(zhǎng)繁殖和酶作用的最適溫度。溫度越高,菌體本身的蛋白質(zhì)和酶易因熱變性和失活也越快,菌體易于衰老,從而影響產(chǎn)物的變化[17]。經(jīng)方差分析可知,不同發(fā)酵溫度對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p<0.01,p<0.01)。所以,綜合考慮發(fā)酵溫度選取37 ℃較佳。

2.2.3 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響 在其他液態(tài)發(fā)酵條件一致下,考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響,結(jié)果見圖4。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Influence of shaker speed on DH of protein and peptide conversion rate

由圖4可知,搖床轉(zhuǎn)速低于180 r/min時(shí),蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率隨著搖床轉(zhuǎn)速變大而增加,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min時(shí),蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率均達(dá)最高。搖床轉(zhuǎn)速高于180 r/min時(shí),蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì),其原因是枯草芽孢桿菌為需氧菌種,發(fā)酵過(guò)程中,搖床轉(zhuǎn)速不同改變了氣態(tài)氧溶解于培養(yǎng)液的速度和含量,進(jìn)而影響菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶及酶作用,即含氧量過(guò)高或過(guò)低均抑制菌種生長(zhǎng)產(chǎn)酶[18],進(jìn)而影響蛋白酶水解底物蛋白的活力。經(jīng)方差分析可知,不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p<0.01,p<0.01)。其中,經(jīng)LSD多重差異比較分析,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min與200、220 r/min之間蛋白水解度差異不顯著(p=0.06>0.05,p=0.06>0.05);所以,綜合考慮搖床轉(zhuǎn)速選取180 r/min較佳。

2.2.4 不同接種量對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響 在其他液態(tài)發(fā)酵條件一致下,考察接種量對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響,結(jié)果見圖5。

圖5 接種量對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響Fig.5 Influence of Inoculum on DH of protein and peptide conversion rate

由圖5可知,接種量為1%(mL/mL)時(shí),蛋白水解度最大。隨著接種量的增加,蛋白水解度呈下降趨勢(shì),接種量為4%時(shí),肽轉(zhuǎn)化率最大,明顯高于其他接種量。經(jīng)方差分析可知,不同接種量對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p<0.01,p<0.01)。經(jīng)LSD多重差異比較分析,接種量4%與2%、3%、5%(mL/mL)之間蛋白水解度差異不顯著(p=0.188>0.05;p=1.000>0.05;p=0.121>0.05),接種量4%與1%之間蛋白水解度差異顯著(p=0.007<0.05)。所以,綜合考慮接種量選取4%較佳。

2.2.5 豆粕和玉米蛋白粉的不同比例對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響 在其他液態(tài)發(fā)酵條件一致下,考察豆粕和玉米蛋白粉的配比對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響,結(jié)果見圖6。

圖6 豆粕和玉米蛋白粉配比對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率影響Fig.6 Influence of Proportion of soybean and corn gluten meal on DH of protein and peptide conversion rate

由圖6可知,在一定瓶裝量下,隨著豆粕質(zhì)量的增加,玉米蛋白粉質(zhì)量的減少,蛋白水解度先增加后減少,肽轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì),主要原因可能是所采用的枯草芽孢桿菌更有利于豆粕的發(fā)酵水解[19]。經(jīng)方差分析可知,豆粕和玉米蛋白粉的不同配比對(duì)蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p<0.01,p<0.01)。當(dāng)豆粕和玉米蛋白粉的配比為2∶1時(shí),蛋白水解度得最大值。此外,結(jié)合尤新[20]和王進(jìn)[12]對(duì)復(fù)配蛋白和復(fù)配肽的研究成果(37%濃縮玉米蛋白粉和63%大豆蛋白粉復(fù)配),豆粕和玉米蛋白粉配比為2∶1時(shí),豆粕和玉米蛋白粉的總氨基酸含量更接近食品FDA氨基酸推薦標(biāo)準(zhǔn)。所以,綜合考慮豆粕和玉米蛋白粉配比確定2∶1為最佳。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用Design-Expert 8.06 軟件進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)與分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 二次回歸方程Y1的顯著性和方差分析

注:*差異顯著(0.01

2.3.2 液態(tài)發(fā)酵工藝的回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得蛋白水解度(Y1)、肽轉(zhuǎn)化率(Y2)與發(fā)酵溫度(X1)、搖床轉(zhuǎn)速(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)、接種量(X4)間的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y1=24.31+0.95X1+1.46X2+3.12X3-0.21X4+1.20X1X2-0.84X1X3-2.15X1X4-2.51X2X3-0.63X2X4+0.28X3X4-6.53X12-4.58X22-3.91X32-1.45X42。

Y2=35.18-5.91X1+3.00X2+0.38X3+1.05X4-0.68X1X2-1.83X1X3+0.41X1X4-1.40X2X3-2.98X2X4+0.42X3X4-11.35X12-5.01X22-0.62X32-1.62X42。

回歸方程Y1和Y2的顯著性及方差分析結(jié)果見表3、表4。

影響蛋白水解度的因素中,發(fā)酵時(shí)間(X3)、搖床轉(zhuǎn)速(X2)、發(fā)酵溫度(X1)均具顯著性(p3<0.0001,p2=0.0025<0.05,p1=0.0316<0.05)。各因素的顯著性順序依次是發(fā)酵時(shí)間>搖床轉(zhuǎn)速>發(fā)酵溫度>接種量。發(fā)酵溫度和接種量(p=0.0074)、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間(p=0.0026)之間存在交互作用,具有顯著性。去除不顯著項(xiàng),得二次回歸精簡(jiǎn)模型方程:Y1=24.31+0.95X1+1.46 X2+3.12X3-2.15X1X4-2.51X2X3-6.53X12-4.58X22-3.91X32-1.45X42,Y1方程可預(yù)測(cè)豆粕和玉米蛋白粉液態(tài)發(fā)酵的蛋白水解度。

影響肽轉(zhuǎn)化率的因素中,發(fā)酵溫度(X1)、搖床轉(zhuǎn)速(X2)、接種量(X4)均具顯著性(p1<0.0001,p1<0.0001,p4=0.0276<0.05),各因素的顯著性順序依次是發(fā)酵溫度>搖床轉(zhuǎn)速>接種量>發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間(p=0.0266)、搖床轉(zhuǎn)速和接種量(p=0.0012)之間存在交互作用,具有顯著性。去除不顯著項(xiàng),得二次回歸精簡(jiǎn)模型方程:Y2=35.18-5.91X1+3.00X2+1.05X4-1.83X1X3-2.98X2X4-11.35X12-5.01X22-1.62X42,Y2方程可預(yù)測(cè)豆粕和玉米蛋白粉液態(tài)發(fā)酵的肽轉(zhuǎn)化率。

表4 二次回歸模型Y2系數(shù)顯著性和方差分析

注:*差異顯著(0.01

2.3.3 響應(yīng)面分析

2.3.3.1 不同因素交互作用對(duì)蛋白水解度的影響分析 根據(jù)回歸方程Y1繪制不同因素的交互作用對(duì)蛋白水解度有較顯著影響的響應(yīng)面立體分析圖,結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 發(fā)酵溫度與接種量交互作用對(duì)蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of interaction between fermentation temperature and inoculum volume on DH of protein

圖8 發(fā)酵時(shí)間與搖床轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of interaction between time and shaker speed on DH of protein

由圖7中響應(yīng)面圖其曲面弧度變化可知,發(fā)酵溫度對(duì)蛋白水解度的影響較顯著(p1=0.0316<0.05),隨著發(fā)酵溫度增大,蛋白水解度增大,達(dá)到一定溫度后,發(fā)酵溫度的繼續(xù)增大使蛋白水解度減小。因其弧度略平,接種量的變化對(duì)蛋白水解度的影響不顯著(p1=0.5971>0.05)。由圖8中響應(yīng)面圖曲面弧度變化可知,搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響均極顯著(p3<0.0001,p2=0.0025<0.05),隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),蛋白水解度增大,達(dá)到一定時(shí)間后,蛋白水解度趨平,變化不明顯。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大,蛋白水解度增大,達(dá)到一定轉(zhuǎn)數(shù)后,蛋白水解度呈下降趨勢(shì)。

2.3.3.2 影響肽轉(zhuǎn)化率的不同因素交互作用分析 根據(jù)回歸方程Y2繪制出對(duì)肽轉(zhuǎn)化率影響較顯著的不同因素交互作用的響應(yīng)面立體分析圖結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合蛋白肽轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot of interaction between fermentation temperature and fermentation time on peptide conversion rate

圖10 搖床轉(zhuǎn)速與接種量對(duì)復(fù)合蛋白肽轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot of interaction between shaker speed and inoculum volume on peptide conversion rate

由圖9中響應(yīng)面圖曲面弧度變化可知,發(fā)酵溫度對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p1<0.0001),隨著發(fā)酵溫度增大,肽轉(zhuǎn)化率增大,達(dá)到一定溫度后,肽轉(zhuǎn)化率下降。發(fā)酵時(shí)間對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響不顯著(p3=0.3821>0.05)。

由圖10中響應(yīng)面圖曲面弧度變化可知,搖床轉(zhuǎn)速對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(p2<0.0001),隨著搖床轉(zhuǎn)速增大,肽轉(zhuǎn)化率增大,達(dá)到一定轉(zhuǎn)數(shù)后,肽轉(zhuǎn)化率變化不顯著。接種量對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響較顯著(p4=0.0276<0.05),隨著接種量的增大,肽轉(zhuǎn)化率增大。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件:發(fā)酵溫度37.83 ℃、搖床轉(zhuǎn)速183.89 r/min,發(fā)酵時(shí)間50.85 h,接種量3.93%。進(jìn)行實(shí)際修正為發(fā)酵溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速184 r/min、發(fā)酵時(shí)間51 h、接種量4%。在此條件下,測(cè)定的豆粕和玉米蛋白粉的蛋白水解度為25.73%±1.78%,肽轉(zhuǎn)化率為33.23%±1.06%,理論預(yù)測(cè)蛋白水解度為24.65%,肽轉(zhuǎn)化率32.83%,相對(duì)誤差分別為4.06%和1.21%,表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆玉米復(fù)合肽工藝條件是可行的。

2.5 大豆肽、玉米肽、大豆玉米復(fù)合肽比較

大豆肽、玉米肽和大豆玉米復(fù)合肽的蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的比較,如圖11。

圖11 大豆肽、玉米肽和大豆玉米復(fù)合肽比較Fig.11 Comparison of soybean peptide,corn peptide,soybean and corn composite peptides

由圖11可知,大豆玉米復(fù)合肽的蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率均較高,枯草芽孢桿菌可有效發(fā)酵豆粕和玉米蛋白粉的復(fù)合蛋白,5 g復(fù)合蛋白發(fā)酵可獲得的大豆玉米復(fù)合肽含量為0.791 g。

3 結(jié)論

基于豆粕和玉米蛋白粉的配比為2∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,以發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間和接種量為考察因素,以蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo),影響蛋白水解度的因素顯著性依次是發(fā)酵時(shí)間>搖床轉(zhuǎn)速>發(fā)酵溫度>接種量;影響肽轉(zhuǎn)化率的因素顯著性依次是發(fā)酵溫度>搖床轉(zhuǎn)速>接種量>發(fā)酵時(shí)間。獲得發(fā)酵豆粕和玉米蛋白粉的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速184 r/min、發(fā)酵時(shí)間51 h、接種量4%。通過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)定的豆粕和玉米蛋白粉的蛋白水解度為25.73%±1.78%,肽轉(zhuǎn)化率為33.23%±1.06%,理論預(yù)測(cè)蛋白水解度為24.65%±1.375%,肽轉(zhuǎn)化率為32.83%±1.475%,蛋白水解度和肽轉(zhuǎn)化率的實(shí)際測(cè)定值與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差分別為4.06%、1.21%。因此,枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制備大豆玉米復(fù)合肽的最佳工藝條件是可行的。

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Optimization on liquid-state fermentation process of composite peptides from soybean and corn proteins

ZHU Zhi-hong,XU Yan-yang*,QIU Yang,GUAN Huan-huan,MIAO Bin-bin

(College of Biological and Agricultural Engineering,Jilin University,Changchun 130022,China)

Soybean and corn gluten meal were mixed as fermentation materials and inoculated with Bacillus subtilis to produce composite peptides from soybean and corn protein. Firstly,effects of fermentation temperature,shaker speed,fermentation time and inoculum volume on degree of hydrolysis(DH)of proteins mixture and conversion rate of peptides were discussed. On the basis of single factor experiments,liquid-state fermentation process conditions of soybean and corn composite peptides were optimized by using four-factor three-level response surface methodology,and corresponding regression models were established. Results showed that proportion of soybean and corn gluten meal was 2∶1 and that optimum fermentation process parameters were as follows:fermentation temperature of 37 ℃,shaker speed of 184 r/min,fermentation time of 51 h,inoculum volume of 4%. Under these liquid-state fermentation conditions,DH of composite proteins was 25.73%±1.78% and peptide conversion rate of 33.23%±1.06%,which was consistent with theoretical prediction values basically. These results contributed to scientific reference for deep manufacture and application of soybean and corn gluten meal.

soybean meal;corn gluten meal;liquid-state fermentation;Bacillusnatto;composite peptides from soybean and corn proteins

2015-05-13

朱志紅(1988-)，女，碩士研究生，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail:zhuzhihong1234@126.com。

*通訊作者:徐艷陽(yáng)(1972-)，女，博士，副教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究，E-mail:xuyy@jlu.edu.cn。

吉林大學(xué)“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽資助項(xiàng)目(450060497060);吉林大學(xué)本科教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2013138)；吉林省高等教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(2014044)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)23-0245-08

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.042